Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Методика по оценке биологической безопасности использования генно-инженерно-модифицированных организмов для производства кормовых добавок" (подготовлен Минсельхозом России 15.05.2017)

Досье на проект

Пояснительная записка

Методика по оценке биологической безопасности использования генно-инженерно-модифицированных организмов для производства кормовых добавок

Введение.

Методика разработана в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации N 839 от 23 сентября 2013 года "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" в части проведения оценки безопасности использования кормовых добавок, содержащих или полученных с использованием генно-инженерно- модифицированных микроорганизмов.

Кормовые добавки определяются как продукты растительного, животного, микробиологического, минерального и синтетического происхождения или их смеси, предназначенные для включения в состав кормов и рационов животных с целью обеспечения физиологической полноценности, профилактики заболеваний (кроме лекарственных средств), стимуляции роста и продуктивности животных (кроме лекарственных средств), обеспечения сохранности компонентов, увеличения доступности питательных веществ и улучшения вкусовых и технологических свойств кормов.

В соответствии с данным определением кормовые добавки могут содержать как ГМО растительного, так и микробного происхождения. Использование ГМО и ГММ в производстве и использовании кормовых добавок должно быть биобезопасным как для животных, так и для окружающей среды.

Для оценки безопасности кормовых добавок, полученных с использованием ГММ, по степени их риска для животных и окружающей среды применяется классификация по следующим категориям:

Категория 1 продукция, содержащая живые/жизнеспособные микроорганизмы (сбраживающие культуры, молочнокислые бактерии и др.).

Категория 2 продукция, содержащая нежизнеспособные/инактивированные ГММ (прошедшие термообработку).

Категория 3 продукция, содержащая отдельные ингредиенты или добавки, синтезируемые ГММ (ферменты, витамины, аминокислоты).

Категория 4 продукция, содержащая содержащие ингредиенты, обработанные синтезируемыми ГММ ферментами и т.п.

Потенциально наиболее безопасна продукция, где ГММ применяются только на производственном этапе в качестве продуцентов (категории 3 и 4). В данном случае критерием оценки рисков применения кормовых добавок является гарантия отсутствия жизнеспособных клеток ГММ и рекомбинантной ДНК в кормовой добавке, а также отсутствие токсичных свойств у веществ, полученных с использованием ГММ продуцентов.

Для второй категории продукции критерием оценки рисков применения является гарантия отсутствия жизнеспособных (способных к самовоспроизводству) ГММ и невозможность передачи генетической информации другим организмам.

Для первой категории применяются те же критерии оценки риска как и для второй категории, а также дополнительно учитывают факторы антагонистического и синергического влияния на естественные микроорганизмы; влияние ГММ на здоровье животных, потенциальную колонизацию в желудочно-кишечном тракте и влияние на естественную микрофлору; возможность переноса генов устойчивости к антибиотикам;

потенциальное воздействие на экосистему.

Применение в кормовых добавках ГМО растительного происхождения также связано с определенными рисками, требующими обязательной оценки при исследования на биобезопасность:

- наличие и непосредственное действие токсичных и аллергенных трансгенных белков ГМО,

- плейотропное действие трансгенных белков на метаболизм растении,

- возможность накопления гербицидов и их метаболитов в устойчивых сортах и видах сельскохозяйственных растении.

- риски горизонтального переноса трансгенных конструкции, в первую очередь в геном симбионтных для человека и животных бактерий (E.coli, Lactobacillus (acidophillus, bifidus, bulgaricus, caucasicus), Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium и др.).

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящая методика устанавливает требования к проведению исследований по оценке биологической безопасности кормовых добавок, содержащих ГМО растительного происхождения, а также кормовых добавок содержащих или полученных с использованием ГММ и оценке их безопасности.

1.2. Требования, изложенные в настоящей методике, обязательны к выполнению при государственной регистрации кормовых добавок, импортируемых в Российскую Федерацию, а также при мониторинге и выборочном контроле качества продукции для ветеринарного использования, содержащей или изготовленной с использованием ГМО.

1.3. Методика разработана с целью обеспечения единой, научно-обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО, МЭБ и др.).

2. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих генно-модифицированные организмы для производства кормовых добавок.

Общая характеристика ГМО и кормовых добавок, содержащих/полученных с использованием ГМО, включает анализ представленной заявителем документации, содержащей:

2.1 - Описание свойств, приобретенных организмом в результате

модификации;

- описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных или измененных генов,

- характеристику различий ГМО с родительским организмом, в том числе описание способа размножения и распространения, схем выращивания, новых фенотипических свойств.

- характеристику генетической и фенотипической стабильности ГМО с указанием различий с родительским организмом. Должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО, характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы)

- для ГМО растительного происхождения характеристику экспрессии встроенных генов в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения, различия с родительским организмом

2.2. Описание методик, позволяющих идентифицировать генетическую модификацию (трансформационное событие для ГМО растительного происхождения) и таксономический статус организма (вид, сорт для растений). В том числе изучаются протоколы проведения анализов, описание нуклеотидных последовательностей используемых праймеров, стандартные образцы состава и свойств;

2.3. Для кормовых добавок, содержащих ГМО растительного происхождения, изучают информацию о схемах выращивания данных ГМО культур, способах размножения, способности к перекрестному опылению, устойчивости к стрессовым воздействиям. Для кормовых добавок, содержащих ГММ, изучают информацию об условиях промышленного культивирования данных ГММ штаммов, оценивают соответствие условий производства требованиям санитарных правил. Для кормовых добавок, получаемых с использованием ГММ продуцентов, изучают технологическую схему промышленного получения веществ, включая подробное описание методов очистки.

2.4. Информацию об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах).

2.5. Информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, данные о токсических, аллергенных свойствах, история использования и др.).

2.6. Информацию о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки).

2.7. Информацию о изучении генетической безопасности и стабильности ГМО.

2.8. При оценке рисков применения кормовых добавок категорий 3 и 4, полученных с использованием ГММ, критерием безопасности является гарантия отсутствия жизнеспособных клеток ГММ и рекомбинантной ДНК в продукции.

При оценки рисков применения кормовых добавок категории 2, содержащих ГММ, важными критериями безопасности являются отсутствие жизнеспособных клеток ГММ, способных к самовоспроизводству и отсутствие возможности передачи генетической информации другим организмам.

Для кормовых добавок, содержащих ГММ категорий 1 и 2 оценивают возможности передачи генетической информации другим организмам. Оценивают данные о характеристике и расположению рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида и другой мобильный генетический элемент); рассматриваются объекты окружающей среды, в которые может попасть рекомбинантная ДНК (желудочно-кишечный тракт животных, навоз, почва, вода, воздух и т.д); стабильность рекомбинантной ДНК в соответствующих условиях окружающей среды; наличие микроорганизмов - потенциальных реципиентов рекомбинантной ДНК в результате горизонтального переноса.

Для кормовых добавок категории 1 дополнительно оценивают следующие факторы:

-конкурентные преимущества ГММ, которым были переданы рекомбинантные гены;

- потенциальное антагонистическое, синергическое или другое влияние на естественные микроорганизмы;

- потенциальное влияние ГММ, которым были переданы рекомбинантные гены на здоровье человека, животных и растений;

- потенциальная колонизация в желудочно-кишечном тракте и влияние на его естественную микрофлору;

- возможность переноса в микрофлоре желудочно-кишечного тракта гена устойчивости к антибиотикам; потенциальное воздействие на экосистему.

Потенциальная опасность попадания ГММ в окружающую среду оценивается по особности ГММ выживать и размножаться в окружающей среде, взаимодействию ГММ с биотическим и абиотическим окружением, включая естественные микроорганизмы, животных и растения.

2.9. По содержанию вредных примесей кормовые добавки, полученные с использованием ГММ, не должны превышать предельно допустимых норм, действующих в Российской Федерации.

2.10. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о

трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков);

- определение аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro;

- определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина);

2.11. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки безопасности одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической, или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank, и др.); изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белка в эксперименте на грызунах; и др.);

- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), - в случае если такие исследования проводились;

- результаты других токсикологических исследований.

2.12. При анализе потенциальной токсичности небелковых веществ, полученных в результате экспрессии ГММ, в кормовых добавках категории 3 и 4, риски оцениваются в каждом конкретном случае в зависимости от концентрации и биологической функции веществ. Изучают метаболизм, токсикокинетику, хроническую токсичность, канцерогенность, воздействие на репродуктивную функцию и тератогенность.

2.13. Для кормовых добавок категорий 1 и 2, изучают результаты токсикологических исследований по следующим показателям: токсикокинетика; генотоксичность; потенциальная аллергенность; результаты субхронического (90 суток) токсикологического эксперимента на лабораторных животных и исследования на продуктивных животных.

2.14. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: результаты определения пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро - и микронутриентов, и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта); результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.

2.15. Анализируют результаты пострегистрационного мониторинга кормовых добавок, полученных с использованием данного ГМО, в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований.

3. Проведение исследований пробиотических ГММ штаммов для производства кормовых добавок.

3.1. Стандартные образцы состава и свойств (ГММ штамм и родительский штамм) в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

3.2. При оценке безопасности ГММ учитываются результаты проведенных экспертами молекулярно-генетических исследований, включающих подтверждение присутствия в геноме ГММ заявленных чужеродных генов, исследований на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, генетической стабильности ГММ, экспрессии рекомбинантных генов, таксономических и др. исследований.

Срок проведения исследования: не более 250 дней.

3.3. Изучаются характерные микробиологические и биохимические свойства ГММ и родительского штамма, а так же чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, гемолитическая активность на эритроцитах человека и животных. Свойства ГММ штамма не должны значительно отличаться от свойств родительского немодифицированного штамма, в том числе ГММ штамм не должен быть более устойчив к антибиотикам и иметь большую гемолитическую активность.

Для биохимической идентификации ГММ и родительского штамма проводят исследование с помощью диагностических панелей, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенными к использованию в установленном порядке.

Стабильность фенотипических свойств проверяют при пассировании исследуемых штаммов на жидких и плотных питательных средах с дальнейшим через 3-5 пассажей тестированием биохимических свойств. Совпадение результатов, выявленное при неоднократном пассировании культур (не менее 10 пассажей) свидетельствует о стабильности фенотипических признаков ГММ и родительского штамма. Вариабельность результатов по большему числу реакций служить свидетельством нестабильности фенотипических признаков у ГММ.

Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных видов ГММ, данные о резистентности родительского штамма, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков. Для определения чувствительности используют метод серийных разведений и диффузионный метод.

Срок проведения исследования: не более 100 дней.

3.4. Определяют адгезивность ГММ и родительского штамма методом гемагглютинации эритроцитов человека и животных (мыши, крысы, кролика, барана и др.) Проводят определение адгезивности ГММ, родительского штамма и референтного (не модифицированный аналог пробиотика) штамма того же вида в отсутствии D-маннозы (маннозо-чувствительная адгезия). При выявлении выраженной гемагглютинационной активности проводят определение адгезивности в присутствии D-маннозы для определения маннозо- чувствительной или маннозорезистентной адгезии.

Количественное определение адгезии проводят in vivo при использовании биологических моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов). По степени адгезивности штаммы оцениваются следующим образом: а) высокоадгезивные с коэффициентом адгезии 3,0 и выше, б) адгезивные - от 1 до 3 и в) слабоадгезивные - 0,001-0,9. Слабоадгезивные штаммы, как правило, авирулентны, а адгезивные и высокоадгезивные штаммы, обычно, обладают определенными вирулентными свойствами. ГММ штамм должен иметь коэффициент адгезии не более 0,9 и он должен быть равен или быть меньше коэффициента адгезии родительского штамма.

Срок проведения исследования: не более 60 дней.

3.5. Определение патогенных и вирулентных свойств ГММ на лабораторных животных - SPF мышах, цыплятах. Определение ЛД50 на SPF мышах проводят путем внутрибрюшинного введения по 0,1 см3 живой суточной культуры исследуемого штамма, в концентрации 1x10(9) , 1x10(7) , 1х10(5) и 1х10(3) КОЕ/см3. Каждую группу животных помещают в отдельную клетку и наблюдают в течение 10 дней за гибелью животных. В качестве контролей используют группы животных, которым внутрибрюшинно вводят: стерильный физиологический раствор или вирулентный штамм с установленной дозой ЛД50. По завершении эксперимента подсчитывают гибель животных в каждой группе и определяют ЛД50. Если ЛД5о равна 5хЮ(8)КОЕ/см и более штамм считают авирулентными. ГММ должен быть не менее безопасен, чем родительский немодифицированный штамм.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.6. Определение инвазивности ГММ. Инвазивность тестируют с помощью кератоконъюктивальной пробы. Сущность метода заключается в том, что возбудитель проникает в эпителиальные клетки конъюктивы и роговицу и размножается в них, вызывая разрушение ткани. ГММ, родительский штамм и контрольный (немодифицированный аналог пробиотика) штамм того же вида, не должны вызывать поражения конъюктивы и роговицы. В случае выраженных инвазивных свойств у штаммов выносится отрицательное заключение о возможности использования ГММ в качестве пробиотического средства.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.7. Определение антагонистической или симбиотической активности ГММ с представителями резидентной микрофлоры кишечника. В качестве контрольных штаммов используют немодифицированный аналог пробиотического штамма того же вида, родительский штамм и штаммы микроорганизмов, представляющие основные виды резидентной кишечной микрофлоры животных (птиц) реципиентов (грамположительные облигатно-анаэробные бактерии - лактобактерии, бифидобактерии, пептострептококки, грамотрицательныеблигатно-анаэробные бактерии, бактероиды, факультативно-анаэробные микроорганизмы, кишечная палочка, стафилококки, стрептококки, дрожжеподобные грибы рода Candida и др.). Используют музейные паспортизованные штаммы.

Из выращенных на плотных или жидких питательных средах контрольных штаммов в присутствии ГММ (родительского штамма или немодифицированного аналога пробиотического штамма того же вида), готовят взвеси микроорганизмов с определенными концентрациями. Вносят по 0,5 см3 10(1), 10(3) и 10(5) КОЕ/см3 каждого штамма в пробирки с жидкой питательной средой по 3,0 см3 , на которой способны расти все исследуемые микроорганизмы (триптиказо-соевый или L-бульон). Параллельно осуществляют посевы контрольных штаммов на селективные питательные среды в тех же разведениях для точного подсчета клеток каждого вида микроорганизма. Через 6 и 24 часов осуществляют посевы смеси микроорганизмов на селективные питательные среды, и подсчитывают количество клеток представителя резидентной микрофлоры и ГММ. Контролями служат посевы, в которых выращивается только представитель резидентной микрофлоры или ГММ. Вычисляют число клеток представителя резидентной микрофлоры, выращенного в присутствии ГММ и отдельно. При приблизительно одинаковом соотношении числа выросших клеток отдельно и в присутствии ГММ считают, что ГММ не обладает антагонистическим действием.

При более высоких показателях числа выросших клеток при совместном выращивании, считают, что виды характеризуются симбиотическим действием.

При снижении количества клеток представителя резидентной микрофлоры в 5 и более раз, в смеси с ГММ, делают вывод об антагонистическом действии ГММ на конкретного представителя нормальной микрофлоры кишечника животных (птиц) реципиентов. В случае, если такое антагонистическое действие ГММ проявляется к большинству из исследованных представителей нормальной микрофлоры кишечника животного, делается заключение о невозможности его использования в качестве пробиотического препарата. При выявлении антагонистического действия ГММ к одному-двум представителям нормальной микрофлоры кишечника оценивают результаты исследований антагонистической активности родительского штамма, проводят исследования in vivo, и молекулярно-генетические исследования по выявлению генов, детерминирующих данный феномен.

Срок проведения исследования; не более 90 дней.

3.8. Иммунологические исследования на лабораторных животных.

Иммунологические исследования пробиотических ГММ проводятся в эксперименте на мышах линий СВА (характеристика: высокочувствительны к введению эритроцитов барана и не чувствительны к гистамину и Salmonella typhimurium) и С57В1/6 (характеристика: низкочувствительны к введению эритроцитов барана, чувствительны к гистамину и Salmonella typhimurium). Исследования включают изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

- действие на гумаральное звено иммунитета в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

- действие на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

- действие как сенсибилизирующего агента в тесте чувствительности к гистамину;

- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

Срок проведения исследования; не более 40 дней.

3.9. Следующие виды испытаний пробиотических средств проводятся в зависимости от родовой (видовой) принадлежности ГММ пробиотического штамма:

ГММ	Потенциальный фактор риска	Исследования
Плесневые грибы	Продукция микотоксинов; антибиотиков	Определение: определение микотоксинов и антибиотиков в пробиотическом препарате
Дрожжи-сахаромицеты	Избыточная продукция этанола; аллергенность	Определение концентрации этанола в пробиотическом препарате; исследования аллергенности
Стрептомицеты	Продукция антибиотиков	Определение антибиотиков в пробиотическом препарате
Споровые бациллы	Избыточная протеолитическая и гемолитическая активности; образование антибиотических веществ	Тесты на острую токсичность пробиотического препарата; гемолиз эритроцитов под воздействием ГММ; определение антибиотиков в пробиотическом препарате
Энтерококки	Образование N- нитрозаминов, гистамина; антибиотико - устойчивость	Определение гистамина, N- нитрозаминов; выявление генов устойчивости к ванкомицину и рифампицину
Лактобациллы гетероферментативные	Избыточное образование D(-) молочной кислоты в продукте	Определение концентрации D(-) молочной кислоты в пробиотическом препарате

Срок проведения исследования: не более 90 дней

4 Проведение исследований кормовых добавок, содержащих нежизнеспособные ГММ, для оценки биологической безопасности.

4.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе образцы кормовых добавок, содержащих нежизнеспособные ГММ, живые культуры ГММ и родительского штаммов в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований представляются заявителем.

4.2. При оценке безопасности ГММ учитываются результаты проведенных экспертами молекулярно-генетических исследований, включающих подтверждение присутствия в геноме ГММ заявленных чужеродных генов и исследований на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, генетической стабильности ГММ, экспрессии рекомбинантных генов, таксономических и др. исследований.

Срок проведения исследования: не более 250 дней.

4.3. Проверяют отсутствие в образцах кормовых добавок жизнеспособных клеток заявленного штамма с использованием микробиологических методов. В качестве контрольных высевов используют живые культуры ГММ и родительского штаммов.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

4.4. Проводятся исследования по изучению безопасности использования кормовых добавок, содержащих нежизнеспособные ГММ для животных или птиц реципиентов. При исследовании, выборке животных скармливают десятикратную дозу кормовой добавки (от предполагаемой к использованию).

Наблюдения проводят в течение месяца. Регистрируют падеж, клиническое состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови. Потребление кормовой добавки с ГММ не должно вызывать видимых клинических изменений и отрицательных реакций, показатели крови также не должны значительно отклоняться от нормы, не должно выявляться патологоанатомических изменений при вскрытии.

Срок проведения исследования: не более 90 дней.

5 Проведение исследований кормовых добавок, содержащих отдельные ингредиенты, синтезируемые ГММ, или полученные с их использованием, для оценки биологической безопасности.

К данной продукции относятся витамины, незаменимые аминокислоты, антибиотики, вещества, обладающие гормональным, иммуномодулирующим действием, ферменты, полученные с использованием ГММ продуцентов. Тип продукции, где ГММ применяются только на производственном этапе в качестве продуцентов, потенциально наиболее безопасен, так как в данном случае технологией предусмотрено полное удаление штамма-продуцента из конечного продукта.

При оценке безопасности данных кормовых добавок для ветеринарного применения учитываются результаты проведенных экспертами молекулярно-генетических исследований, включающих подтверждение отсутствия в препарате рекомбинантной ДНК.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

6. Проведение исследований ГМО растительного происхождения для производства кормовых добавок, для оценки биологической безопасности.

6.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе ГМО растительного происхождения и его традиционный аналог в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

6.2. При оценке безопасности ГМО учитываются результаты проведенных экспертами молекулярно-генетических исследований, включающих подтверждение присутствия в геноме ГМО заявленных чужеродных генов, исследований на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, генетической стабильности ГМО, экспрессии рекомбинантных генов, таксономических и др исследований.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

6.3. Гигиенические исследования ГМО включают определение показателей качества и безопасности. Изучаемые показатели: содержание токсичных элементов; микотоксинов; пестицидов; радионуклидов; вредных примесей; микробиологические показатели.

Перечень показателей безопасности определяется на основании требований:

ГОСТ Р 54319-2011 "Мука кормовая. Технические условия". Ветеринарно-санитарные нормы и требования к качеству кормов для непродуктивных животных N 13-7-2/2010 от 15 июля 1997 г.

ГОСТ 2116-2000 "Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и позвоночных. Технические условия".

ГОСТ 25311-82 "Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа".

ГОСТ 17536-82 "Мука кормовая животного происхождения. Технические условия".

ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикормовое сырьё. Методы определения общей токсичности".

ГОСТ 17681-82 "Мука животного происхождения. Методы испытаний".

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

6.4 Оценка композиционной эквивалентности ГМО растительного происхождения и традиционного аналога проводится с целью исключения риска снижения их биологической полноценности. Сравниваются кормовая ценность нового и традиционного продукта (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро - и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида); нормы потребления; способы использования; биодоступность и переваримость; влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные, исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон. Если в результате оценки композиционной эквивалентности не обнаруживается отличий ГМО продукции от традиционных аналогов, то ее считают полностью безвредной для здоровья животных. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения.

6.5. Токсикологические исследования ГМО растительного происхождения на лабораторных животных.

Эксперимент проводится на крысах линии Вистар (самцы в возрасте 40-50 дней, исходная масса тела 70-80 г). Животных делят на 2 группы, группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО. Количество животных в группе в начале эксперимента - не менее 50 особей в каждой группе. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион, ПКР, содержащий казеин, крахмал маисовый, масло подсолнечное нерафинированное, лярд, солевая смесь (хлористый натрий, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, кальций

углекислый, железо сернокислое, калии иодистыи, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислая, кобальт хлористый, натрий фтористый, алюмокалиевые квасцы), витамины (В1, В2, В6, В12, никотиновая кислота, пантотенат кальция, фолиевая кислота, цианкобаламина, викасол, L-метионин, ретинола ацетат, эршкальциферол,токоферола ацетат), микрокристаллическая целлюлоза. Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности. Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

Исследуются следующие показатели: общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова) - каждые 2 дня; поедаемость корма - ежедневно; масса тела- каждые 7 дней. Массу внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, семенники) оценивают на 30-й и 180-й дни эксперимента.

Проводят забор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований у 10 животных каждой группы на 30-й и 180-й дни эксперимента.

Оценивают показатели:

- гематологические показатели крови: концентрация гемоглобина; гематокрит; общее количество эритроцитов; средний объем эритроцита (СОЭ); среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); общее количество тромбоцитов; общее количество лейкоцитов; дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы);

- биохимические показатели крови: аланинаминотрансфераза (AJ1T); аспартатаминотрансфераза (ACT); желчные кислоты; фосфатаза щелочная; билирубин общий; билирубин прямой; белок общий; альбумин; глобулин; креатинин; глюкоза; альфа-амилаза; липаза; лактатдегидрогеназа; общие липиды; триглицериды; холестерин;холинэстераза; мочевина; хлориды; натрий; фосфор; калий;

- общий анализ мочи; изучаемые показатели суточный диурез; цвет и прозрачность; относительная плотность; pH; белок; глюкоза; креатинин;

- биомаркеры системы антиоксидантной защиты (материал для

исследований: эритроциты); изучаемые показатели активность ферментов антиоксидантной защиты: глутатионредуктазы; глутатионпероксидазы;

супероксиддисмутазы; каталазы;

- биомаркеры системы антиоксидантной защиты (материал для

исследований: кровь, печень); изучаемые показатели: содержание продуктов перекисного окисления липидов: малоновый диальдегид;

- система ферментов метаболизма ксенобиотиков (материал для исследований: печень); изучаемые показатели: активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков: общее содержание цитохрома Р-450; 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; 7-пентоксирезоруфин-О-деэтилаза; UDP- глюкуронозилтрансфераза; глутатионтрансфераза;

- система регуляции апоптоза, стабильность мембран лизосом (материал для исследований: печень); изучаемые показатели: общая и неседиментируемая активность-ферментов лизосом, галактозидаза; глюкуронидаза; арилсульфатазы А и В.

Проводят морфологические исследования кожи; головного мозга; сердца; аорты; селезенки; легких. Выполняют макроскопические и микроскопические исследования, обзорные гистологические, морфометрический анализ на 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый забор). Для поджелудочной железы; почек; семенников проводят микроскопические (электронно-микроскопические), гистохимические; иммуногистохимические исследования.

Для погибших в течение эксперимента животных (внеплановый забор) проводят также дополнительно морфологические исследования лимфатических узлов; тимуса; щитовидной железы; гипофиза; желудка, тонкой и толстой кишки; печени для установления причины смерти.

Срок проведения исследования: не более 200 дней.

6.6. Иммунологические исследования ГМО растительного происхождения на лабораторных животных.

Иммунологические исследования ГМО растительного происхождения, проводятся в эксперименте на мышах линий СВА (характеристика: высокочувствительны к введению эритроцитов барана и не чувствительны к гистамину и Salmonella typhimurium) и С57В1/6 (характеристика: низкокочувствительны к введению эритроцитов барана, чувствительны к гистамину и Salmonella typhimurium). Исследования включают изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

- действие на гуморальное звено иммунитета в тесте определения

уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

- действие на клеточное звено иммунитета в реакции

гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

- действие как сенсибилизирующего агента в тесте чувствительности

к гистамину;

- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

Срок проведения исследования: не более 40 дней.

6.7. Аллергологические исследования ГМО растительного происхождения на лабораторных животных.

Потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG + IgG) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка.

Эксперимент проводится на крысах линии Вистар (половозрелые самцы, исходная масса тела 150-180 г). Животных делят на 2 группы, группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО. Количество животных в группе в начале эксперимента - не менее 25 особей в каждой группе. На протяжении эксперимента животные получают стандартный рацион вивария (на 1 крысу в день: крупа овсяная 2,5 г, зерновая смесь 14,0 г., хлеб 2 сорт 4,0 г., творог 2,0 г., рыбная мука 0,5 г, мясо 2 категории 4,0 г., морковь 8,0г., зелень 8,0г., рыбий жир 0,1г., дрожжи 0,1 г., NaCl 0,15г.; основные нутриенты белок 3,69 г. жир 1,28 г., углеводы 12,42 г.; энергия, 76,0 ккал). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности. Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка. Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и, затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1-0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител. Проводят иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА.

Тяжесть реакции анафилактического шока в каждой из групп животных оценивают по анафилактическому индексу, учитывающему тяжесть реакции анафилаксии, и проценту летальных реакций анафилаксии.

Срок проведения исследования: не более 40 дней.

На основании экспертизы представленных документов и материалов, результатов проведенных молекулярно-генетических исследований и оценки биологического риска использования выдается заключения о возможности использования данного продукта для ветеринарных целей на территории РФ.