Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов для производства лекарственных средств для ветеринарного применения" (подготовлен Минсельхозом России 15.05.2017)

Досье на проект

Пояснительная записка

Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов для производства лекарственных средств для ветеринарного применения

Методика разработана в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации N 839 от 23 сентября 2013 года "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" в части проведения молекулярно-генетических исследований при оценке безопасности генно-инженерно-модифицированные организмов для производства лекарственных средств для ветеринарного применения.

Лекарственные средства, полученные с использованием генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ), можно разделить на следующие категории:

Категория 1 - иммунобиологические и пробиотические препараты, содержащие живые/жизнеспособные микроорганизмы (вирусные векторные вакцины, живые бактериальные вакцины, пробиотические препараты, содержащие штаммы бактерий, дрожжей, мицелярных грибов).

Категория 2  - иммунобиологические препараты, содержащие нежизнеспособные микроорганизмы (инактивированные вакцины).

Категория 3 - лекарственные препараты, содержащие компоненты (ферменты, моноклональные антитела, антибиотики, витамины, аминокислоты, гормоны), полученные с использованием ГММ продуцентов.

Цель проведения исследований - оценка безопасности ГММ для животных и окружающей среды в соответствии с тем видом использования, для которого они предназначены.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящая методика устанавливает требования к проведению молекулярно-генетических исследований при контроле за ГММ штаммами, используемыми при производстве лекарственных средств для ветеринарного применения.

1.2. Требования, изложенные в настоящей методике обязательны к выполнению при государственной регистрации ГММ штаммов для целевого использования при производстве лекарственных средств для ветеринарного применения, а также при государственной регистрации, мониторинге и выборочном контроле качества иммунобиологических, пробиотических и лекарственных средств для ветеринарного применения, полученных из ГММ штаммов или с их использованием.

1.3. Методика разработана с целью обеспечения единой, научно - обоснованной системы оценки биологической безопасности ГММ, и учитывает современные методические подходы, разработанные в России и рекомендованные международными организациями (МЭБ, ВОЗ, ФАО и др.).

2. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих ГММ для производства лекарственных средств для ветеринарного применения

Общая характеристика ГММ включает анализ представленной заявителем документации, содержащей:

2.1 Описание свойств, приобретенных ГММ штаммом в результате модификации:

- описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных или измененных генов;

- характеристику различий ГММ с родительским организмом, в том числе описание способа размножения и распространения, схемы выращивания, новых фенотипических свойств;

- характеристику генетической и фенотипической стабильности ГММ, в том числе характеристику способности к переносу трансгенов в другие организмы.

2.2. Описание методик, позволяющих идентифицировать ГММ штамм (подтвердить его таксономический статус и характеристику генетической модификации). В том числе протоколы проведения анализов, описание нуклеотидных последовательностей используемых праймеров, стандартные образцы состава и свойств.

2.3 Исчерпывающие сведения об исходном родительском микроорганизме (таксономическая характеристика, описание способов размножения и распространения, данные о вирулентных, аллергенных и других биологических свойствах).

2.4. Информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, данные о вирулентных, аллергенных и других свойствах).

2.5. Информацию о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки);

2.6. Информацию об изучении генетической безопасности и стабильности ГММ штамма.

2.7. Результаты других молекулярно-генетических исследований, в случае, если такие исследования были выполнены.

2.8. Результаты пострегистрационнош мониторинга ГММ штаммов и препаратов его содержащих, в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований.?

3. Проведение молекулярно-генетических исследований ГММ штаммов для производства лекарственных средств для ветеринарного применения

Экспертное молекулярно-генетические исследование включает подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций ГММ штамма.

3.1. Культуры ГММ и родительского штаммов в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

3.2. Для подтверждения присутствия заявленных чужеродных генов в определенном месте в геноме микроорганизма, а также для проверки на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, проводится секвенирование геномов ГММ и родительского штаммов.

Для полногеномного секвенирования используют метод детекции флуоресцентных сигналов меченых нуклеотидов, включающихся в процессе синтеза in situ в состав поверхностных молекулярных кластеров.

Проводят выделение геномной ДНК (РНК) из ГММ и родительского штаммов с использованием наборов реагентов в соответствии с рекомендациями производителя оборудования. Готовят ДНК библиотеки ГММ и родительского штаммов с использованием наборов для секвенирования с одного конца или с двух концов.

Длина чтения составляет по 36 нуклеотидов с одного конца фрагмента или по 150 нуклеотидов с каждого конца фрагмента. Для анализа полученных кластерных изображений и их конвертации в последовательности ДНК используют соответствующие анализатору программные пакеты. Глубина покрытия чтения генома по всем областям должна составлять не менее 20 раз. При выравнивании геномов выявляется место локализации заявленной генетической модификации, регуляторные и маркерные векторные последовательности ГММ. Сравнивают полученные данные о структуре генетической конструкции и месте ее локализации со сведениями, предоставленными заявителем.

Исследуемые штаммы микроорганизмов (ГММ и родительский) должны различаться только в области заявленной генетической модификации, в остальных областях генома идентичность нуклеотидных последовательностей должна составлять не менее 99%.

Срок проведения исследования: не более 180 дней.

3.3. Проводят проверку (валидацию) ПЦР методики идентификации линии ГММ, представленную заявителем, оценивают ее чувствительность и специфичность.

Протокол проведения анализа, предоставленный заявителем, включает описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Синтез олигонуклеотидов, используемых в качестве ПЦР праймеров, проводят в соответствии с представленной информацией об их нуклеотидных последовательностях.

Необходимое для ПЦР диагностики специализированное оборудование описано в стандартах ИСО 20837:2006 и ИСО 20838:2006. Исследование включает последовательные процессы: подготовка проб, выделение

нуклеинового материала (ДНК или РНК) из образца препарата, амплификацию ДНК (кДНК), детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов. При исследовании генетически

модифицированных РНК-вирусов для выделения нуклеинового материала рекомендуется использование набора "РНК СОРБ" производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии или аналогичного. При исследовании генетически модифицированных ДНК вирусов, бактерий, дрожжей, мицелярных грибов для выделения ДНК из образцов рекомендуется использование готового набора. Для проведения ПЦР и ОТ-ПЦР рекомендуется использование термостабильной ДНК полимеразы, обратной транскриптазы, смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, десятикратных буферов для проведения реакций. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом электрофоретического разделения ПЦР фрагментов в агарозном геле. Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

ПЦР методика должна иметь 100% специфичность (отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации до 1x106 геномных эквивалентов /мл) и высокую чувствительность (не менее 1x104 геномных эквивалентов/мл).

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.4. Проводят анализ функционирования целевой вставки с выявлением продуктов экспрессии целевого гена используя с определением:

- количества мРНК, транскрибируемой с целевого гена, методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);

- наличия рекомбинантного белка методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле. Проводят сравнение профилей белковых паттернов ГММ штамма и родительского штамма;

- специфичности рекомбинантного белка методом иммуноблотинга.

Срок проведения исследования: не более 60 дней.

3.5. Для определения генетической стабильности ГММ штаммов вирусов применяют полногеномное секвенирование после шести пассажей на культуре клеток или в живых организмах.

Для определения генетической стабильности ГММ штаммов бактерий, дрожжей, мицеллярных грибов проводят не менее десяти пересевов (пассажей) на жидких и плотных питательных средах с последующим полным секвенированием генома микроорганизма.

Штамм ГММ признается генетически стабильным и безопасными, если не выявляется генетических изменений в геноме, в том числе не происходит появления мутаций, частичной или полной потери модифицированного фрагмента или его переноса в другие области генома после, по крайней мере, десятикратного пассирования для ГММ штаммов бактерий, дрожжей, мицелярных грибов и шестикратного пассирования для ГММ штаммов вируса.

Срок проведения исследования: не более 250 дней.

3.6. Для оценки стабильности экспрессии чужеродного гена ГММ штаммов вирусов проводят оценку изменения продукции рекомбинантного белка при шестикратном пассировании на культурах клеток (по п.3.4).

Для оценки стабильности экспрессии чужеродного гена ГММ штаммов бактерий, дрожжей, мицелярных грибов проводят анализ функционирования целевой вставки после десятикратного пассировании на жидких и плотных питательных средах (по п.3.4). Уровень экспрессии рекомбинантного белка должен быть стабилен.

Срок проведения исследования: не более 150 дней.

4. Проведение молекулярно-генетических исследований лекарственных средств полученных из/ или с использованием ГММ.

Экспертное молекулярно-генетические исследование лекарственных средств полученных из/или с использованием ГММ включает подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций.

4.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе образцы лекарственного средства полученного из/ или с использованием ГММ, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

4.2. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные и нежизнеспособные ГММ, подтверждается присутствие в геноме заявленных чужеродных генов. Выявляется место их локализации, регуляторные и/или маркерные векторные последовательности. Исследование ГММ на наличие заявленных модификаций проводится с использованием валидированной (см п.3.3) методики ПЦР-идентификации, предложенной

заявителем/производителем. Валидированная методика идентификации данного ГММ может быть также получена из других авторитетных источников.

Результаты ПЦР анализа дополнительно подтверждаются определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру с терминирующими дидезоксинуклеозидтрифосфатами. Для проведения секвенирования рекомендуется использование анализаторов, позволяющих надежно определять нуклеотидную последовательность ДНК длиной до 500- 800 пар нуклеотидов в одном прочтении.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

4.3. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные и нежизнеспособные ГММ, проводят подтверждение таксономической принадлежности ГММ, определяя нуклеотидную последовательность фрагментов генома штамма-реципиента. В случае генетически модифицированных бактерий обычно выявляют последовательность

консервативного участка генома - фрагмента 16S рРНК гена. Исследование проводится с помощью амплификации фрагмента ДНК с универсальными

праймерами 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) и U1492R (5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) или видоспецифичными к заявленному штамму праймерами с последующим определением нуклеотидной

последовательности секвенированием по Сэнгеру. В случае генетически модифицированных вирусов в качестве мишени выбирают область генома, не затронутую генетической модификацией (гены гликопротеинов, капсидных, матриксных белков и др). Выбирают специфические олигонуклеотидные праймеры с использованием специального

программного обеспечения в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ПЦР праймерам, специфичность праймеров оценивается путем выравнивания с различными геномами с использованием алгоритма локального выравнивания в базах данных последовательностей. Чувствительность и специфичность выбранных праймеров подтверждают на препаратах ДНК/РНК из штаммов различных микроорганизмов (требуемая чувствительность - не менее 1x104 геномных эквивалентов/мл, отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации до 1x106 геномных эквивалентов /мл). По результатам секвенирования ПЦР фрагментов, полученных с использованием данных праймеров, оценивают генетическую однородность ГММ из лекарственного препарата и проводят филогенетический анализ искомой последовательности с аналогичными последовательностями из баз нуклеотидных последовательностей с использованием надлежащего программного обеспечения.

При необходимости установления штаммовой принадлежности ГММ проводят дополнительные исследования методом секвенирования протяженных участков генома, полученных с помощью ПЦР амплификации со специфичными праймерами.

Срок проведения исследования: не более 70 дней.

4.4. В случае лекарственных средств, где ГММ штаммы применяются в качестве продуцентов (категория 3), производственной технологией предусмотрено полное удаление штамма-продуцента из конечного продукта (очистка). Для исключения рисков, связанных с нарушением технологии производства и неполным удаления при очистке компонентов (клеточного содержимого) штамма продуцента, а также опасности присутствия жизнеспособного ГММ, проводят ПЦР исследование для подтверждения отсутствия трансгенных последовательностей ГММ в конечном продукте.

Для выделения ДНК из лекарственных препаратов (ферменты, моноклональные антитела, антибиотики, аминокислоты, витамины и др.)

рекомендуется использование готового набора.

ПЦР диагностика проводится с использованием валидированной (см п.3.3) методики ПЦР-идентификации линии генетической модификации штамма продуцента, представленной заявителем. В качестве положительного контроля используют нуклеиновый материал ГММ штамма продуцента.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

4.5. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные ГММ проводят анализ функционирования целевой вставки с выявлением продуктов экспрессии целевого гена:

- определением мРНК, транскрибируемой с целевого гена, методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);

определением наличия рекомбинантного белка методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле, проводят сравнение профилей белковых паттернов ГММ штамма и родительского штамма;

определения специфичности рекомбинантного белка методом и мму нобл отинга.

Срок проведения исследования: не более 60 дней.

4.6. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы вирусов, оценивают генетическую стабильность по наличию изменений в нуклеотидной последовательности генома после шести пассажей вируса на культуре клеток или в живых организмах.

Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы бактерий, дрожжей, мицеллярных грибов оценивают генетическую стабильность по наличию изменений в нуклеотидной последовательности генома после 10 пересевов (пассажей) на жидких и плотных питательных средах.

Для определения генетической стабильности применяют секвенирование по Сэнгеру, рестрикционный анализ генома.

Штаммы ГММ признаются генетически стабильными и безопасными, если не выявляется генетических изменений в геноме ГММ, в том числе не происходит появления мутаций, частичной или полной потери модифицированного фрагмента или его переноса в другие области генома после, по крайней мере, шестикратного пассирования.

Срок проведения исследования: не более 180 дней.

4.7. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы вирусов, проводят оценку стабильности экспрессии чужеродного гена с выявлением изменений после шестикратного пассирования на культурах клеток (по п. 4.5).

Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы бактерий, дрожжей, мицелярных грибов проводят оценку стабильности экспрессии чужеродного гена с выявлением изменений после после десятикратного пассировании на жидких и плотных питательных средах (по п. 4.5.).

Уровень экспрессии рекомбинантного белка должен быть стабилен.

Срок проведения исследования: не более 150 дней.

4.8. Для лекарственных препаратов, содержащих жизнеспособные и нежизнеспособные ГММ, проводят скрининговые исследования на наличие незаявленных генетических модификаций. Исследование проводится на основании рекомендаций международных организаций (ФАО/ВОЗ/МЭБ) и предусматривает выявление ДНК последовательностей наиболее часто употребляемых плазмидных векторов, с помощью которых генетическая информация вводится в организм.

Для выявления наиболее типичных маркерных и селективных генов (генов антибиотикорезистентности, бактериоцинов, ?-галактозидазы, ?-глюкоронидазы, РНК полимеразы бактериофага Т7, регуляторных последовательностей промоторов и терминаторов, полилинкеров, последовательности мигрирующих элементов транспозируемых векторов), используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантных ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы) применяют многокомпонентные наборы реагентов и праймеров (искусственно синтезированных олигонуклеотидов, комплементарных соответствующим участкам ДНК-мишени). Обнаружение таких последовательностей свидетельствует о возможном присутствии незаявленных генетических модификаций, и требует проведения дополнительных исследований. Информация о последовательностях маркерных и селективных генов, являющихся составляющими частями генноинженерных конструкций доступна в международных базах. Специфические олигонуклеотидные праймеры для идентификации данных последовательностей выбираются с использованием надлежащего программного обеспечения в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ПЦР праймерам. Специфичность праймеров оценивается путем выравнивания с различными геномами с использованием алгоритма локального выравнивания в базах данных. Специфичность и чувствительность выбранных праймеров подтверждают на препаратах ДНК из штаммов различных микроорганизмов (требуемая чувствительность - не менее 1x104 геномных эквивалентов/мл, отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации не менее 1x106 геномных эквивалентов /мл). Примеры пар ПЦР-праймеров, предназначенных для выявления маркерных и селективных генов ГММ при скрининговых ПЦР-исследованиях на наличие незаявленных генетических модификаций приведены в таблице 1.

Таблица 1.

ПЦР- праймеры для выявления некоторых маркерных и селективных генов, являющихся составляющими частями генноинженерных конструкций

Мишень	Описание	ПЦР-праймеры, 5′ - 3′
Ген LacZ	Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется ввекторных плазмидных конструкциях pCR2.1 ТОРО, pVIK 112, pBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии экспрессирующие LacZ, имеют голубой цвет	AGGGGGATGTGCT
Ген gfp	Ген зелёного флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp и других) в качестве светящейся метки.	Gfp-F: TTGTTGATATTAGATGGCGATGT ТА         Gfp-R: TTTGGAAAGGGCAGATT GTGT
Ген amp	Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, pET, pCR2.1 ТОРО и других	Amp-F: GTGGGCTATATCGAACTGGA Amp-R: CCCGTCGTGTAGATA ACTACG
Ген Km	Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, рМС212 и других)	Km-F: CGGAAGGAATGTCTCCTGC Km-R: CGACATACTGTTCTTCCCCG
Ген tetO	Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322 и других)	TetO-F: CGCCTGCAGAGGGCGGCACGG АТСА     TetO-R: CGCCTGCAGGGCCAACGTTCC ААСС
Fl ori	Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 ТОРО и других)	fl-F: ТАAGCGCGGCGGGTGTGGT     fl-R: TTGGGGTCGAGGTGCСGTAAA
Транспо Tn7L	Фрагмент обеспечивает транс-позицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp и др.)	IncP- F: CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG     IncP- R: GGGCAGGATAGGTGAAGTAGG
R6K ori	Ориджин репликации плазмид (pVIK112 и др.)	R6K-F: GACAAA
Ген еrmC	Кодирует устойчивость к эритромицину плазмидных векторов	ErmC-F: AGTAC AG AGGTGTA АТТТС G ErmC-R AATTCCTGCATGTTTTAAGG
Ген cat	Кодирует устойчивость к хлорамфениколу плазмидных векторов	Cat-F: ATGAACTTTAATAААATTGАТТТ AGA Cat-R: AGCATTTTTCAGGTATAGGTG

При обнаружении генетических модификаций проводят дальнейшие исследования с целью идентификации конкретной генетической конструкции ГММ.

Срок проведения исследования: не более 90 дней.

При получении результатов, противоречащих или не соответствующих характеристикам, декларированным заявителем/производителем, проводят двухкратные повторные арбитражные исследования.