Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Методика по оценке биологической безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения для производства кормов" (подготовлен Минсельхозом России 15.05.2017)

Досье на проект

Пояснительная записка

Методика по оценке биологической безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения для производства кормов

Введение

Методика разработана в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации N 839 от 23 сентября 2013 года "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" в части проведения оценки безопасности ГМО растительного происхождения для производства кормов.

ГМ растения нашли широкое применение в сельском хозяйстве, в частности, в составе кормов для животных и птиц. Одной из главных задач селекции растений является повышение качества и количества синтезируемых ими белков, жиров, полисахаридов и других веществ, определяющих их питательную ценность. Использование генно-инженерных методов при создании новых сортов позволяет ввести в геном полезный признак, без сцепления с отрицательными свойствами, в том числе позволяет создавать растения, устойчивые к стрессовым влияниям окружающей среды, к гербицидам, насекомым, болезням различной этиологии.

Оценка биологической безопасности использования ГМО для производства кормов проводится в целях определения возможных вредных воздействий ГМО на здоровье животных и степени опасности таких воздействий. Исследование проводится при сравнении модифицированного растения с его традиционным аналогом, имеющим историю безопасного использования. Принимаются во внимание общие черты и различия. При проведении исследований должна быть установлена безопасность любых эффектов, возникших в результате генетической модификации; безопасность новых белков, возникших в результате генетической модификации (токсичность, аллергенность и др.); композиционная эквивалентность, отсутствие снижения биологической ценности кормов, содержащих ГМО.

При оценке рисков использования ГМО необходимо учитывать также их потенциальную опасность для окружающей среды, в том числе необходимо оценить возможность переноса генов в родственные и/или другие виды дикорастущих растений; возможности изменениях восприимчивости растений к болезням и вредным организмам.

1. Общие положения и область применения

1.1 Настоящая методика устанавливает требования к проведению исследований по оценке биологической безопасности ГМО растительного происхождения для производства кормов, а также кормов, содержащих ГМО.

1.2. Требования, изложенные в настоящей методике обязательны к выполнению при государственной регистрации ГМ линий растительного происхождения и кормов, содержащих ГМО растительного происхождения, а также при мониторинге и выборочном контроле качества продукции для ветеринарного использования, содержащей или изготовленной с использованием ГМО.

1.3. Методика разработана с целью обеспечения единой, научно - обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывает новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО, МЭБ и др.).

2. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих ГМО растительного происхождения для производства кормов.

Общая характеристика ГМО растительного происхождения и кормов, содержащих ГМО, включает анализ представленной заявителем документации, содержащей:

2.1. - Описание свойств, приобретенных организмом в результате модификации;

- описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных или измененных генов,

- характеристику различий ГМО с родительским организмом, в том числе описание способа размножения и распространения, схем выращивания, новых фенотипических свойств.

- характеристику генетической и фенотипической стабильности ГМО с указанием различий с родительским организмом. Должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО, характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы);

- характеристику экспрессии встроенных генов в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения, различия с родительским организмом;

2.2. Изучают информацию о схемах выращивания данной ГМО культуры, способах размножения, способности к перекрестному опылению, устойчивости к стрессовым воздействиям и др., с указанием различий с родительским организмом.

2.3. Информацию об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах).

2.4 Информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, данные о токсических, аллергенных свойствах, история использования и др.).

2.5. Информацию о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки).

2.6. Информацию об изучении генетической безопасности и стабильности ГМО.

2.7. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании сведений, представленных заявителем, о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога по следующим параметрам: содержание белка; аминокислотный состав; содержание жира; жирнокислотный состав; углеводный состав; содержание витаминов; содержание макро - и микроэлементов; содержание биологически активных веществ; содержание аллергенов; содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.); содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов данного вида.

Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида.

2.8. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки безопасности одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической, или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank, и др.); изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и рН, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белка в эксперименте на грызунах; и др.);

- результаты оценки безопасности нативного продукта: данные 90-дневных исследований на грызунах; данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), в случае если такие исследования проводились;

- результаты других токсикологических исследований.

2.9. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в т.ч. in vivo);

- результаты аллергологических исследований нативного продукта должны быть проведены в случае, если имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.).

2.10. По содержанию вредных примесей ГМО культуры и корма, содержащие ГМО, не должны превышать предельно допустимых норм, действующих в Российской Федерации.

2.11. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: результаты определения пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро - и микронутриентов, и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта); результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.

2.12. Анализируют результаты пострегистрационного мониторинга ГМО и кормов его содержащих, в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований.

3. Минимальный перечень исследований для регистрации ГМО растительного происхождения для производства кормов для оценки биологической безопасности.

3.1. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, подтверждение присутствия в геноме ГМО заявленных чужеродных генов, исследований на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, генетической стабильности ГМО.

3.2. Гигиенические исследования ГМО, включающие определение показателей качества и безопасности. Изучаемые показатели: содержание токсичных элементов; микотоксинов; пестицидов; радионуклидов; вредных примесей; микробиологические показатели.

3.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО растительного происхождения и традиционного аналога с целью исключения риска снижения их биологической полноценности. Перечень исследуемых показателей качества определяется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. С учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида, сравниваются кормовая ценность нового и традиционного продукта (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, биологически активных веществ, антинутриентов, аллергенов; антропогенных и природных контаминантов - токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей) и других веществ, характерных для растений данного вида); нормы потребления; способы использования; биодоступность и переваримость; влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта.

3.4. Токсикологические исследование ГМО растительного происхождения на лабораторных животных на 5 поколениях с изучением репродуктивной токсичности. Эксперимент проводится на крысах линии Вистар (самцы в возрасте 40-50 дней, исходная масса тела 70-80 г). Животных делят на 2 группы, группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО. Количество животных в группе в начале эксперимента - не менее 50 особей в каждой группе. Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении.

Исследуются следующие показатели: общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова) - каждые 2 дня; поедаемость корма - ежедневно; масса тела - каждые 7 дней. Массу внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, семенники) оценивают на 30-й и 180-й дни эксперимента.

Проводят забор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований у 10 животных каждой группы на 30-й и 180-й дни эксперимента.

Оценивают показатели:

- гематологические показатели крови: концентрация гемоглобина; гематокрит; общее количество эритроцитов; средний объем эритроцита (СОЭ); среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); общее количество тромбоцитов; общее количество лейкоцитов; дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы);

- биохимические показатели крови: аланинаминотрансфераза (АЛТ); аспартатаминотрансфераза (АСТ); желчные кислоты; фосфатаза щелочная; билирубин общий; билирубин прямой; белок общий; альбумин; глобулин; креатинин; глюкоза; альфа-амилаза; липаза; лактатдегидрогеназа; общие липиды; триглицериды; холестерин; холинэстераза; мочевина; хлориды; натрий; фосфор; калий;

- общий анализ мочи; изучаемые показатели суточный диурез; цвет и прозрачность; относительная плотность; pH; белок; глюкоза; креатинин;

- биомаркеры cистемы антиоксидантной защиты (материал для исследований: эритроциты); изучаемые показатели активность ферментов антиоксидантной защиты: глутатионредуктазы; глутатионпероксидазы; супероксиддисмутазы; каталазы;

- биомаркеры cистемы антиоксидантной защиты (материал для исследований: кровь, печень); изучаемые показатели: содержание продуктов перекисного окисления липидов: малоновый диальдегид;

- cистема ферментов метаболизма ксенобиотиков (материал для исследований: печень); изучаемые показатели: активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков: общее содержание цитохрома Р-450; 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; 7-пентоксирезоруфин-О-деэтилаза; UDP-глюкуронозилтрансфераза; глутатионтрансфераза;

- cистема регуляции апоптоза, стабильность мембран лизосом (материал для исследований: печень); изучаемые показатели: общая и неседиментируемая активность-ферментов лизосом, галактозидаза; глюкуронидаза; арилсульфатазы А и В.

Проводят морфологические исследования кожи; головного мозга; сердца; аорты; селезенки; легких. Выполняют макроскопические и микроскопические исследования, обзорные гистологические, морфометрический анализ на 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый забор). Для поджелудочной железы; почек; семенников проводят микроскопические (электронно-микроскопические), гистохимические; иммуногистохимические исследования.

Для погибших в течение эксперимента животных (внеплановый забор) проводят также дополнительно морфологические исследования лимфатических узлов; тимуса; щитовидной железы; гипофиза; желудка, тонкой и толстой кишки; печени для установления причины смерти.

Оценивают показатели, характеризующие генеративную функцию:

-морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза);

- морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм).

Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства:

- Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок на группу;

- Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации, количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной эмбриональной смертности) на 19-20-й день беременности;

- Анализ эмбрионального материала (не менее 5 плодов от каждой крысы)

Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства:

- Контроль рождения потомства на 20-22-й дни беременности;

- Учет величины помета в день родов, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, установление внешних уродств, измерение массы тела, определение краниокаудального размера на 1-й день жизни;

- Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища; выживаемость потомства на 1-30 дни жизни;

- Измерение массы тела и роста крысят на 1, 4, 7, 14, 21 и 25 дни жизни.

Отчет по результатам исследований репродуктивной токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции.

3.5. Иммунологические исследования ГМО растительного происхождения и его традиционного аналога на лабораторных животных.

Исследования проводятся в эксперименте на мышах линий СВА (высокочувствительных к введению эритроцитов барана и не чувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium) и С57Bl/6 (низкочувствительных к введению эритроцитов барана, чувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium). Исследования включают изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

- действие на гуморальное звено иммунитета в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

- действие на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

- действие как сенсибилизирующего агента в тесте чувствительности к гистамину;

- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

3.6. Аллергологические исследования ГМО растительного происхождения на лабораторных животных.

Потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (cубклассов IgG + IgG) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка.

Эксперимент проводится на крысах линии Вистар (половозрелые самцы, исходная масса тела 150-180 г). Животных делят на 2 группы, группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО. Количество животных в группе в начале эксперимента - не менее 25 особей в каждой группе. На протяжении эксперимента животные получают стандартный рацион вивария. Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности. Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка. Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении.

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1-0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител. Проводят иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА.

Тяжесть реакции анафилактического шока в каждой из групп животных оценивают по анафилактическому индексу, учитывающему тяжесть реакции анафилаксии, и проценту летальных реакций анафилаксии

На основании экспертизы представленных документов и материалов, результатов проведенных молекулярно-генетических исследований и оценки биологического риска использования, выдается заключение о возможности использования данного продукта для производства кормов и кормовых добавок на территории Российской Федерации.