Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов для производства кормовых добавок" (подготовлен Минсельхозом России 15.05.2017)

Досье на проект

Пояснительная записка

Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов для производства кормовых добавок

Введение.

Методика разработана в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации N 839 от 23 сентября 2013 года "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" в части проведения молекулярно-генетических исследований при оценке безопасности ГМО для производства кормовых добавок.

Кормовые добавки определяются как продукты растительного, животного, микробиологического, минерального и синтетического происхождения или их смеси, предназначенные для включения в состав кормов и рационов животных с целью обеспечения физиологической полноценности, профилактики заболеваний (кроме лекарственных средств), стимуляции роста и продуктивности животных (кроме лекарственных средств), обеспечения сохранности компонентов, увеличения доступности питательных веществ и улучшения вкусовых и технологических свойств кормов.

В соответствии с данным определением кормовые добавки могут содержать как ГМО растительного, животного, так и микробного происхождения. Использование ГМО и ГММ в производстве и использовании кормовых добавок должно быть биобезопасным как для животных, так и для окружающей среды.

Для оценки безопасности кормовых добавок, полученных с использованием ГММ, по степени их риска для животных и окружающей среды применяется классификация по следующим категориям:

Категория 1 продукция, содержащая живые/жизнеспособные микроорганизмы (сбраживающие культуры, молочнокислые бактерии и др.).

Категория 2 продукция, содержащая нежизнеспособные/инактивированные ГММ (прошедшие термообработку).

Категория 3 продукция, содержащая отдельные ингредиенты или добавки, синтезируемые ГММ (ферменты, витамины, аминокислоты).

Категория 4 продукция, содержащая содержащие ингредиенты, обработанные синтезируемыми ГММ ферментами и т.п.

Потенциально наиболее безопасна продукция, где ГММ применяются только на производственном этапе в качестве продуцентов (категория 3 и 4). В данном случае критерием оценки рисков применения кормовых добавок является гарантия отсутствия жизнеспособных клеток ГММ и рекомбинантной ДНК в кормовой добавке, а также отсутствие токсичных свойств у веществ, полученных с использованием ГММ продуцентов.

Для второй категории продукции критерием оценки рисков применения является гарантия отсутствия жизнеспособных (способных к самовоспроизводству) ГММ и невозможность передачи генетической информации другим организмам.

Для первой категории применяются те же критерии оценки риска как и для второй категории, а также дополнительно учитывают факторы антагонистического и синергического влияния на естественные микроорганизмы; влияние ГММ на здоровье животных, потенциальную колонизацию в желудочно-кишечном тракте и влияние на естественную микрофлору; возможность переноса генов устойчивости к антибиотикам; потенциальное воздействие на экосистему.

Применением в кормовых добавках ГМО растительного происхождения также связано с определенными рисками, требующими обязательной оценки при исследования на биобезопасность:

- наличие и непосредственное действие токсичных и аллергенных трансгенных белков ГМО,

- плейотропное действие трансгенных белков на метаболизм растений,

- возможность накопления гербицидов и их метаболитов в устойчивых сортах и видах сельскохозяйственных растений.

- риски горизонтального переноса трансгенных конструкций, в первую очередь в геном симбионтных для человека и животных бактерий (E.coli, Lactobacillus (acidophillus, bifidus, bulgaricus, caucasicus), Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium и др.).

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящая методика применяется при проведении молекулярно-генетических исследований при контроле за ГММ штаммами и ГМО растительного происхождения, используемыми при производстве кормовых добавок, а также кормовых добавок, содержащих (или полученных с использованием) ГМО и оценке их безопасности.

1.2. Методика предназначена для применения при государственной регистрации ГММ штаммов для целевого использования при производстве кормовых добавок, при государственной регистрации, мониторинге и выборочном контроле качества кормовых добавок, содержащих ГМО растительного происхождения, а также кормовых добавок содержащих или полученных с использованием ГММ.

1.3. Методика разработана с целью обеспечения единой, научно - обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО, МЭБ и др.).

2. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих генно-инженерно-модифицированные организмы для производства кормовых добавок.

Общая характеристика ГМО и кормовых добавок, содержащих/полученных с использованием ГМО, включает анализ представленной заявителем документации, содержащей:

2.1. Описание свойств, приобретенных организмом в результате модификации;

- описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных или измененных генов,

- характеристику различий ГМО с родительским организмом, в том числе описание способа размножения и распространения, схем выращивания, новых фенотипических свойств.

- характеристику генетической и фенотипической стабильности ГМО с указанием различий с родительским организмом. Должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО, характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы)

- для ГМО растительного происхождения характеристику экспрессии встроенных генов в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения, различия с родительским организмом

2.2. Описание методик, позволяющих идентифицировать генетическую модификации (трансформационное событие для ГМО растительного происхождения) и таксономический статус организма (вид, сорт для растений). В том числе изучаются протоколы проведения анализов, описание нуклеотидных последовательностей используемых праймеров, стандартные образцы состава и свойств.

2.3. Информацию об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах).

2.4. Информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, данные о токсических, аллергенных свойствах, история использования и др.).

2.5 Информацию о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки).

2.6. Информацию об изучении генетической безопасности и стабильности ГМО.

2.8. При оценке рисков применения кормовых добавок категорий 3 и 4, полученных с использованием ГММ, критерием безопасности является гарантия отсутствия рекомбинантной ДНК в продукции.

2.9. Для кормовых добавок, содержащих ГММ категорий 1 и 2 оценивают возможности передачи генетической информации другим организмам. Оценивают данные о характеристике и расположению рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида и другой мобильный генетический элемент); рассматриваются объекты окружающей среды, в которые может попасть рекомбинантная ДНК (желудочно-кишечный тракт животных, навоз, почва, вода, воздух и т.д); стабильность рекомбинантной ДНК в соответствующих условиях окружающей среды; наличие микроорганизмов - потенциальных реципиентов рекомбинантной ДНК в результате горизонтального переноса.

Для кормовых добавок категории 1 дополнительно оценивают следующие факторы:

-конкурентные преимущества ГММ, которым были переданы рекомбинантные гены;

- потенциальное антагонистическое, синергическое или другое влияние на естественные микроорганизмы;

- потенциальное влияние ГММ, которым были переданы рекомбинантные гены на здоровье человека, животных и растений;

- потенциальная колонизация в желудочно-кишечном тракте и влияние на его естественную микрофлору;

- возможность переноса в микрофлоре желудочно-кишечного тракта гена устойчивости к антибиотикам; потенциальное воздействие на экосистему.

2.7. Анализируют результаты пострегистрационного мониторинга ГМО и препаратов его содержащих, в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований.

3. Проведение молекулярно-генетических исследований пробиотических ГММ штаммов для производства кормовых добавок для ветеринарного применения

Экспертное молекулярно-генетические исследование включает подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций ГММ штамма.

3.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе культуры ГММ и его немодифицированного аналога в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

3.2. Для подтверждения присутствия заявленных чужеродных генов в определенном месте в геноме микроорганизма, а также для проверки на наличие возможных недекларированных генетических модификаций, проводится секвенирование геномов ГММ и родительского штаммов.

Для полногеномного секвенирования используют метод детекции флуоресцентных сигналов меченых нуклеотидов, включающихся в процессе синтеза in situ в состав поверхностных молекулярных кластеров.

Проводят выделение геномной ДНК из ГММ и родительского штаммов с использованием наборов реагентов в соответствии с рекомендациями производителя оборудования. Готовят ДНК библиотеки ГММ и родительского штаммов с использованием наборов для секвенирования с одного конца или с двух концов в зависимости от используемого анализатора.

Длина чтения составляет по 36 нуклеотидов с одного конца фрагмента и по 150 нуклеотидов c каждого конца фрагмента в зависимости от используемого анализатора. Для анализа полученных кластерных изображений и их конвертации в последовательности ДНК используют соответствующие анализатору программные средства. Глубина покрытия чтения генома по всем областям должна составлять не менее 20 раз. При выравнивании геномов выявляется место локализации заявленной генетической модификации, регуляторные и маркерные векторные последовательности ГММ. Сравнивают полученные данные о структуре генетической конструкции и месте ее локализации со сведениями, предоставленными заявителем.

Исследуемые штаммы микроорганизмов (ГММ и родительский) должны различаться только в области заявленной генетической модификации, в остальных областях генома идентичность нуклеотидных последовательностей должна составлять не менее 99%.

Срок проведения исследования: не более 180 дней.

3.3. Проводят проверку (валидацию) ПЦР методики идентификации линии ГММ, представленную заявителем, оценивают ее чувствительность и специфичность.

Протокол проведения анализа, предоставленный заявителем, включает описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Синтез олигонуклеотидов, используемых в качестве ПЦР праймеров, проводят в соответствии с представленной информацией об их нуклеотидных последовательностях.

Необходимое для ПЦР диагностики специализированное оборудование описано в стандартах ИСО 20837:2006 и ИСО 20838:2006. Исследование включает последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца препарата, амплификацию ДНК, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов. При исследовании генетически модифицированных бактерий, дрожжей, мицелярных грибов для выделения ДНК из образцов рекомендуется использование готового набора. Для проведения ПЦР рекомендуется использование термостабильной ДНК полимеразы, смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, десятикратных буферов для проведения реакций. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом электрофоретического разделения ПЦР фрагментов в агарозном геле. Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

ПЦР методика должна иметь 100% специфичность (отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации до 1х106 геномных эквивалентов /мл) и высокую чувствительность (не менее 1х104 геномных эквивалентов/мл).

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.4. Проводят анализ функционирования целевой вставки с выявлением продуктов экспрессии целевого гена используя с определением:

- количества мРНК, транскрибируемой с целевого гена, методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);

- наличия рекомбинантного белка методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле. Проводят сравнение профилей белковых паттернов ГММ штамма и родительского штамма;

- специфичности рекомбинантного белка методом иммуноблотинга.

Срок проведения исследования: не более 60 дней.

3.5. Для определения генетической стабильности ГММ штаммов бактерий, дрожжей, мицеллярных грибов проводят не менее десяти пересевов (пассажей) на жидких и плотных питательных средах с последующим полным секвенированием генома микроорганизма.

Штамм ГММ признается генетически стабильным и безопасными, если не выявляется генетических изменений в геноме, в том числе не происходит появления мутаций, частичной или полной потери модифицированного фрагмента или его переноса в другие области генома после, по крайней мере, десятикратного пассирования.

Срок проведения исследования: не более 250 дней.

3.6 Для оценки стабильности экспрессии чужеродного гена ГММ штаммов бактерий, дрожжей, мицелярных грибов проводят анализ функционирования целевой вставки после десятикратного пассировании на жидких и плотных питательных средах (по п. 3.4). Уровень экспрессии рекомбинантного белка должен быть стабилен.

Срок проведения исследования: не более 150 дней.

4. Проведение молекулярно-генетических исследований кормовых добавок, полученных из/ или с использованием ГММ.

Экспертное молекулярно-генетические исследование кормовых добавок, полученных из/ или с использованием ГММ включает подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций.

4.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе образцы кормовой добавки, полученной из/ или с использованием ГММ, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

4.2. При проведении исследования ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД, для выделения ДНК из образцов используют готовый набор. При проведении исследования кормовых добавок, содержащих растительные компоненты, для выделения ДНК из образцов используют готовый набор.

Для кормовых добавок категорий 1 и 2 в обязательном порядке подтверждается присутствие в геноме ГММ заявленных чужеродных генов. Выявляется место их локализации, регуляторные и/или маркерные векторные последовательности. Исследование ГММ на наличие заявленных модификаций проводится с использованием валидированной (см п. 3.3) методики ПЦР-идентификации, предложенной заявителем/ производителем. Валидированная методика идентификации данного ГММ может быть также получена из других авторитетных источников.

Результаты ПЦР анализа дополнительно подтверждаются определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру с терминирующими дидезоксинуклеозидтрифосфатами. Для проведения секвенирования рекомендуется использование системы любого генетических анализаторов и других аналогичных приборов, позволяющих надежно определять нуклеотидную последовательность ДНК длиной до 500-800 пар нуклеотидов в одном прочтении.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

4.3. Для кормовых добавок категорий 1 и 2 проводят подтверждение таксономической принадлежности ГММ, определяя нуклеотидную последовательность фрагментов генома штамма-реципиента. При возможности выделения чистой культуры ГММ исследование проводится с помощью амплификации фрагмента ДНК с универсальными праймерами 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) и U1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′), в других случаях используют видоспецифичные к заявленному штамму праймеры с последующим определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру. Проводят филогенетический анализ искомой последовательности с аналогичными последовательностями из доступных баз данных с использованием надлежащего программного обеспечения. Устанавливают наиболее генетически близкий исследуемому микроорганизм.

Срок проведения исследования: не более 70 дней.

4.4. Для кормовых добавок категорий 3 и 4, где ГММ штаммы применяются в качестве продуцентов ферментов, аминокислот, витаминов и др. пребиотических веществ, производственной технологией предусмотрено полное удаление штамма-продуцента из конечного продукта (очистка). Для исключения рисков, связанных с нарушением технологии производства и неполным удаления при очистке компонентов (клеточного содержимого) штамма-продуцента, а также опасности присутствия жизнеспособного ГММ, проводят ПЦР исследование для подтверждения отсутствия трансгенных последовательностей ГММ в конечном продукте.

Выделение ДНК из кормовых добавок проводится по п. 4.2. Для ПЦР-идентификации линии генетической модификации штамма продуцента используют валидированную методику (см п.3.3) представленную заявителем. В качестве положительного контроля используют нуклеиновый материал ГММ штамма продуцента.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

4.5. Для кормовых добавок категории 1, содержащих жизнеспособные ГММ, проводят анализ функционирования целевой вставки с выявлением продуктов экспрессии целевого гена:

- определением мРНК, транскрибируемой с целевого гена, методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);

- определением наличия рекомбинантного белка методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле; проводят сравнение профилей белковых паттернов ГММ штамма и родительского штамма;

- определения специфичности рекомбинантного белка методом иммуноблотинга.

Срок проведения исследования: не более 60 дней.

4.6. Для кормовых добавок категории 1, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы бактерий, дрожжей, мицелярных грибов, оценивают генетическую стабильность по наличию изменений в нуклеотидной последовательности генома после 10 пересевов (пассажей) на жидких и плотных питательных средах.

Для определения генетической стабильности применяют секвенирование по Сэнгеру, рестрикционный анализ генома.

Штаммы ГММ признаются генетически стабильными и безопасными, если не выявляется генетических изменений в геноме ГММ, в том числе не происходит появления мутаций, частичной или полной потери модифицированного фрагмента или его переноса в другие области генома после, по крайней мере, десятикратного пассирования.

Срок проведения исследования: не более 180 дней.

4.7. Для кормовых добавок категории 1, содержащих жизнеспособные ГММ штаммы бактерий, дрожжей, мицелярных грибов проводят оценку стабильности экспрессии чужеродного гена с выявлением изменений после после десятикратного пассировании на жидких и плотных питательных средах (по п. 4.5.).

Уровень экспрессии рекомбинантного белка должен быть стабилен.

Срок проведения исследования: не более 150 дней.

4.8. Для кормовых добавок категорий 1 и 2 проводят скрининговые исследования на наличие незаявленных генетических модификаций. Исследование проводится на основании рекомендаций международных организаций (ФАО/ВОЗ/МЭБ) и предусматривает выявление ДНК последовательностей наиболее часто употребляемых плазмидных векторов, с помощью которых генетическая информация вводится в клетку.

Для выявления наиболее типичных маркерных и селективных генов (генов антибиотикорезистентности, бактериоцинов, ?-галактозидазы, ?-глюкоронидазы, РНК полимеразы бактериофага Т7, регуляторных последовательностей промоторов и терминаторов, полилинкеров, последовательности мигрирующих элементов транспозируемых векторов), используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантной ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы), применяют многокомпонентные ПЦР наборы реагентов и праймеров. Обнаружение перечисленных последовательностей свидетельствует о возможном присутствии незаявленных генетических модификаций и требует проведения дополнительных исследований. Информация о последовательностях маркерных и селективных генов, являющихся составляющими частями генноинженерных конструкций доступна в международных базах. Специфические олигонуклеотидные праймеры для идентификации данных последовательностей выбираются с использованием программ в соответствии c требованиями, предъявляемыми к ПЦР праймерам. Специфичность и чувствительность выбранных праймеров подтверждают на препаратах ДНК из штаммов различных микроорганизмов (требуемая чувствительность - не менее 1х104 геномных эквивалентов/мл, отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации не менее 1х106 геномных эквивалентов /мл). Примеры пар ПЦР-праймеров, предназначенных для выявления маркерных и селективных генов ГММ при скрининговых ПЦР-исследованиях на наличие незаявленных генетических модификаций приведены в таблице 1.

Таблица 1.

ПЦР - праймеры для выявления некоторых маркерных и селективных генов, являющихся составляющими частями генноинженерных конструкций

Мишень	Описание	ПЦР-праймеры, 5′ - 3′
Ген LacZ	Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1TOPO, pVIK112, рBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирование рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии экспрессиирующие LacZ, имеют голубой цвет.	LacZ-F: ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT     LacZ-R: GCTGGCGAA AGGGGGATGTGCT
Ген gfp	Ген зелёного флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp и других) в качестве светящейся метки.	Gfp-F: TTGTTGATATTAGATGGCGATGTTA     Gfp-R: TTTGGAAAGGGCAGATTGTGT
Ген amp	Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, рUC18, pBSKSII, рЕТ, pCR2.1 TOPO и других)	Amp-F: GTGGGCTATATCGAACTGGA     Amp-R: CCCGTCGTGTAGATA ACTACG
Ген Km	Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212 и других)	Km-F: CGGAAGGAATGTCTCCTGC     Km-R: CGACATACTGTTCTTCCCCG
Ген tetO	Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322 и других)	TetО-F: CGCCTGCAGAGGGCGGCACGGATCA     TetО-R: CGCCTGCAGGGCCAACGTTCCAACC
F1 ori	Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO и других)	f1-F: TAAGCGCGGCGGGTGTGGT     f1-R: TTGGGGTCGAGGTGCCGTAAA
Транспозон Tn7L	Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp и др.)	IncP-F: CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG     IncP-R:GGGCAGGATAGGTGAAGTAGG
R6K ori	Ориджин репликации плазмид (pVIK112 и др.)	R6K-F: GACAAA AAGGATCCAGCAGTT     R6K-R: AGTACGTTAGCCATGAGGGTT
Ген ermC	Кодирует устойчивость к эритромицину плазмидных векторов	ErmC-F: AGTACAGAGGTGTAATTTCG     ErmC-R :AATTCCTGCATGTTTTAAGG
Ген сat	Кодирует устойчивость к хлорамфениколу плазмидных векторов	Сat-F: ATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGA Cat-R: AGCATTTTTCAGGTATAGGTG

При обнаружении генетических модификаций проводят дальнейшие исследования с целью идентификации конкретной генетической конструкции ГММ.

Срок проведения исследования: не более 90 дней.

5. Проведение молекулярно-генетических исследований ГМО растительного происхождения для производства кормовых добавок.

Экспертное молекулярно-генетическое исследование включает подтверждение предоставленных заявителем данных, проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций ГМО культуры, а также изучения влияния генетической модификации на функционирование генома ГМ растения.

5.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе культуры ГМО и его традиционного аналога, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

5.2. Проводят проверку (валидацию) ПЦР методик обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, представленных заявителем, оценивают чувствительность и специфичность.

Протоколы проведения анализа, предоставленные заявителем, порядке включают описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Синтез олигонуклеотидов, используемых в качестве ПЦР праймеров, проводят в соответствии с представленной информацией об их нуклеотидных последовательностях.

Необходимое для ПЦР диагностики специализированное оборудование описано в стандартах ИСО 20837:2006 и ИСО 20838:2006. Исследование включает последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца препарата, амплификацию ДНК, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов.

Выделение ДНК из образцов растительного происхождения проводят СТАВ или сорбционным методами в соответствии с ГОСТ Р 52173. Для выделения ДНК сорбционным методом рекомендуется использовать готовый набор реагентов с наставлениями производителя.

Для проведения ПЦР рекомендуется использование термостабильной ДНК-полимеразы, смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, десятикратных буферов для проведения реакций. В зависимости от методики детекция продуктов амплификации осуществляется посредством электрофоретического разделения ПЦР фрагментов в агарозном геле с учётом наличия или отсутствия на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК или посредством учета накопления сигнала флуоресценции в процессе ПЦР при гибридизационно-флюоресцентной детекции.

ПЦР методики должны иметь 100% специфичность (отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации до 1х106 геномных эквивалентов /мл) и высокую чувствительность (не менее 1х104 геномных эквивалентов/мл).

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

5.3. Подтверждается присутствие в геноме ГМО заявленных трансгенов, выявляется место их локализации, выявляются регуляторные и/или маркерные векторные последовательности. Исследование ГМО на наличие заявленных модификаций проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих описание молекулярной структуры генетических конструкций (нуклеотидная последовательность, локализация в геноме реципиента) с использованием валидированных методик идентификации (см п. 3.2.) представленных заявителем/производителем или полученных из авторитетных источников.

Для выявления ДНК регуляторных областей, содержащихся в заявленной генетической конструкции, используют валидированные ПЦР методики (см п. 3.2.) или описанные в стандартах ISO/FDIS 21569:2005 и других авторитетных научных источниках. Примеры пар ПЦР-праймеров, приведены в таблице 2.

Для выявления ДНК наиболее распространенных регуляторных областей, промоторов р- CaMV35S, р-FMV, терминатора t-NOS, используют готовые ПЦР наборы.

Таблица 2. ПЦР- праймеры для выявления регуляторных элементов генноинженерных конструкций ГМО растительного происхождения

Элемент	ГМ линии сои, кукурузы и рапса содержащие данный элемент	5′ - 3′ последовательности праймеров и зондов
Промотор р-CaMV35S	GTS 40-3-2, A2704-12, A5547-127, BT 176, BT11, MON810, GA21, MON88017, NK603, MON863, T25, Т45 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT FAM-TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA-ТAMRA     ПЦР с электрофоретической детекцией GCTCCTACAAATGCCATCA GATAGTGGGATTGTGCGTCA Размер ПЦР продукта 195 п.н.
Терминатор t-NOS	GTS 40-3-2, MON863, MON531, MON757, MON1076, MON1445, MON1698, MON15985, BT11, GA21, NK603, MON802, 3272, MIR604, MON88017 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CATgTAATgCATgACgTTATTTATg TTgTTTTCTATCgCgTATTAAATgT (YY)-ATgggTTTTTATgATTAgAgTCCCgCAA-(BHQ1)     ПЦР с электрофоретической детекцией GAATCCTGTTGCCGGTCTTG TTATCCTAGTTTGCGCGCTA Размер ПЦР продукта 180 п.н.
Промотор р-FMV	MON89788, MON89034, GT73 и др.	AAGCCTCAACAAGGTCAG CTGCTCGATGTTGACAAG Размер ПЦР продукта 196 п.н.
Промотор p-SSuAra	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GGCCTAAGGAGAGGTGTTGAGA CTCATAGATAACGATAAGATTCATGGAATT FAM-CCTTATCGGCTTGAACCGCTGGAATAA-TAMRA
Промотор p-TA29	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GAAGCTGTGCTAGAGAAGATGTTTATTC GCTCGAAGTATGCACATTTAGCAA FAM-AGTCCAGCCACCCACCTTATGCAAGTC-TAMRA
Промотор p-NOS	MS1, RF1, RF2, Topas 19-2 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GTGACCTTAGGCGACTTTTGAAC CGCGGGTTTCTGGAGTTTAA FAM-CGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTGCTTAGC-TAMRA
Терминатор t-E9	MON89788 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: TGAGAATGAACAAAAGGACCATATCA TTTTTATTCGGTTTTCGCTATCG FAM-TCATTAACTCTTCTCCATCCATTTCCATTTCACAGT-TAMRA
Терминатор t-35S	BT 176, Т14, Т25, 3272, A2704-12, A5547-127, Т45, Topas19/2 и др.	ПЦР с электрофоретической детекцией GAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTC TTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAG
Терминатор t-OCS	MS1, RF1, RF2 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CGGTCAAACCTAAAAGACTGATTACA CGCTCGGTGTCGTAGATACT FAM-TCTTATTCAAATTTCAAAAGTGCCCCAGGG-TAMRA
Терминатор t-g7	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: ATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTTCAA R ATGTATTACACATAATATCGCACTCAGTCT FAM-ACTGATTATATCAGCTGGTACATTGCCGTAGATGA-TAMRA

Для идентификации и подтверждения ГМ линии (трансформационного события) используют представленную заявителем информацию (см. п. 5.2.) и/или валидированные методики из авторитетных источников. Протокол проведения анализа, предоставленный заявителем, включает описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Предлагаемые в некоторых авторитетных научных источниках праймеры для ПЦР-идентификации некоторых ГМО линий приведены в табл 3.

Табл. 3. Праймеры для выявления некоторых линий ГМ кукурузы, сои и рапса в соответствии с методиками из некоторых авторитетных научных источников.

Целевая ДНК	5′ - 3′ последовательности праймеров и зондов
Кукуруза, линия DAS-40278-9	CACGAACCATTGAGTTACAATC FAM-CGTAGCTAACCTTCATTGTATTCCG-TAMRA TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTG
Кукуруза, линия MON87460	CACGTTGAAGGAAAATGGATTG FAM- AGGGAGTATGTAGATAAATTTTCAAAGCGTTAGACGGC-TAMRA TCGCGATCCTCCTCAAAGAC
Кукуруза, линия Bt11	GCGGAACCCCTATTTGTTTA FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA TCCAAGAATCCCTCCATGAG
Кукуруза, линия GA21	CTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA FAM-CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGT- TAMRA TGGCTCGCGATCCTCCT
Кукуруза, линии NK603	ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT
Кукуруза, линия MON863	TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT FAM-TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA-TAMRA GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC
Кукуруза, линия TC1507	TAGTCTTCGGCCAGAATGG FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-TAMRA CTTTGCCAAGATCAAGCG
Кукуруза, линия T25	ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA GACATGATACTCCTTCCACCG
Кукуруза, линия 59122	GGGATAAGCAAGTAAAAGCGCTC FAM-TTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAA-TAMRA CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAG
Кукуруза, линия MIR604	GCGCACGCAATTCAACAG FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT
Кукуруза, линия MON88017	GAGCAGGACCTGCAGAAGCT FAM-TCCCGCCTTCAGTTTAAACAGAGTCGGGT-TAMRA TCCGGAGTTGACCATCCA
Кукуруза, линия LY038	TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT FAM-CGAGCGGAGTTTATGGGTCGACGG-TAMRA AGGAATTCGATATCAAGCTTATCGA
Кукуруза, линия MON89034	TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGBNFQ CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA
Кукуруза, линия 3272	TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGG FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG-TAMRA CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA
Кукуруза, линия MON810	TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT
Кукуруза, линия 98140	GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT FAM-CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATAGTTTAAACT-TAMRA GATTGTCGTTTCCCGCCTTC
Кукуруза, линия MIR162	GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG FAM-TCTAGACAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCCA- TAMRA TGCCTTATCTGTTGCCTTCAGA
Кукуруза LY038	TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT AGGAATTCGATATCAAGCTTATCGA FAM-CGAGCGGAGTTTATGGGTCGACGG-TAMRA
Кукуруза, линия Bt176	GGCCGTGAACGAGCTGTT FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-TAMRA GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA
Соя, линия FG72	AGATTTGATCGGGCTGCAGG FAM-AATGTGGTTCATCCGTCTT-MGBNFQ GCACGTATTGATGACCGCATTA
Соя, линия MON87769	CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATT FAM-CCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGAC-TAMRA GCAAGTTGCTCGTGAAGTTTTG-3′
Соя, линия MON 87705	TTCCCGGACATGAAGCCATTTAC FAM-AAGAGACTCAGGGTGTTGTTATCACTGCGG- TAMRA ACAACGGTGCCTTGGCCCAAAG-3′
Соя, линия A2704-12	GCAAAAAAGCGGTTAGCTCCT FAM-CGGTCCTCCGATCGCCCTTCC-TAMRA ATTCAGGCTGCGCAACTGTT
Соя, линия GTS-40-3-2	TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT FAM-CCTTTTCCATTTGGG-MGB-NFQ GGCATTTGTAGGAGCCACCTT
Соя, линия MON89788	TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT-3′ FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA TCGAGCAGGACCTGCAGAA
Соя, линия A5547-127	GCTATTTGGTGGCATTTTTCCA FAM-CCGCAATGTCATACCGTCATCGTTGT-TAMRA CACTGCGGCCAACTTACTTCT
Соя, линия 305423	CGTGTTCTCTTTTTGGCTAGC FAM-TGACACAAATGATTTTCATACAAAAGTCGAGA-TAMRA GTGACCAATGAATACATAACACAAACTA
Соя, линия DP-356043-5	GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT
Соя, линия MON87701	TGGTGATATGAAGATACATGCTTAGCAT 6-FAM-TCAGTGTTTGACACACACACTAAGCGTGCC- TAMRA CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAA
Соя, линия CV127	5′-AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTAAGAC 6-FAM-TTTGGGGAAGCTGTCCCATGCCC-TAMRA 5′-CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC
Рапс, линия T45	CA ATGGACACATGA ATTATGC GACTCTGTATGAACTGTTCGC FAM-TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT-TAMRA
Рапс, линия Ms8	GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGG- GGAGGGTGTTTTTGGTTATC FAM-AATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTC-TAMRA
Рапс, линия Rf3	CATAAAGGAAGATGGAGACTTGAG 5′-AGCATTTAGCATGTACCATCAGACA FAM-CGCACGCTTATCGACCATAAGCCCA-TAMRA′
Рапс, линия GT73	5′-CCATATTGACCATCATACTCATTGCT 5′-GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-TAMRA
Рапс, линия Ms1	ACGCTGCGGACATCTACATT CTAGATCGGAAGCTGAAGATGG FAM-CTCATTGCTGATCCACCTAGCCGACTT-TAMRA
Рапс, линия, RF1	CTAAGGGAGGTCAAGATGTAGC CGGGCCTAACTTTTGGTGTG FAM-CTCATCATCCTCACCCAGTCAGCATCA-TAMRA
Рапс, линия, RF2	GGGTGAGACAATATATCGACG GGGCATCGCACCGGTGAG′ FAM-CACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGT-TAMRA
Рапс. Topas 19/2	GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC CGACCGGCGCTGATATATGA FAM-TCCCGCGTCATCGGCGG-TAMRA

В исследуемом образце должны выявляться регуляторные области, заявленные для данной линии ГМО растительного происхождения, и заявленное трансформационное событие.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

5.4. Проводят скрининговые исследования на наличие в исследуемом образце незаявленных ГМ линий растительного происхождения:

- регуляторных и/или маркерных последовательностей, вносимых в геном растений при генетических модификациях

- наиболее часто вносимых для получения желаемых признаков целевых трансгенов.

Выявление регуляторных элементов ГМО проводят по п. 5.3. (табл 2).

Примеры пар ПЦР-праймеров, предназначенных для выявления наиболее часто вносимых для получения желаемых признаков целевых трансгенов приведены в табл. 3. Использование данных пар праймеров позволяет идентифицировать основные специфичные для ГМ растений гены: pat и bar, обеспечивающие устойчивость к фосфинотрицину (глюфосинату аммония), cp4 epsp, придающий устойчивость к глифосату, ген cryIA(b), придающий устойчивость к кукурузному мотыльку.

Таблица 4. ПЦР- праймеры для выявления целевых трансгенов наиболее часто вносимых в геном растений для получения желаемых признаков

Целевой ген	ГМО	ПЦР- праймеры/ зонды, 5′ 3′
ген рat фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы Streptomyces viridochromogenes	линии кукурузы 3272, Bt10, Bt11, GA21, MIR604, 4114, 5307, TC1507, MIR162, 59122, MON810, NK603, MON88017, 676, 678, 680, 98140, DAS40278, Т25 и их гибриды.	TTGAGGGTGTTGTGGCTGGTA     FAM-CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGCA-TAMRA     TGTCCAATCGTAAGCGTTCCT
ген bar фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus	линии кукурузы Bt176, CBH-351, DBT418, DLL25, MS3, MS6, TC6275, сои W62, W98 и др.	ACAAGCACGGTCAACTTCC GAGGTCGTCCGTCCACTC FAM-TACCGAGCCGC AGGA ACC-TAMR A
ген cp4 epsp энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы из СР4 штамма Agrobacterium tumefaciens	линии кукурузы MON802, MON809,MON81, NK603, сои MON87708, MON87769, пшеницы MON87769 и др.	GGGATGACGTTAATTGGCTCTG     GGCTGCTTGCACCGTGAAG     FAM-CACGCCGTGGAAACAGAAGACATGACCTAMRA
Синтетический ген cryIA(b) белка токсина Bacillus thuringiensis	Линии кукурузы BT-176, MON802, MON809, MON810	CCCATCGACATCAGCCTGAGC     FAM-ATGTCCACCAGGCCCAGCACG-TAMRA     CAGGAAGGCGTCCCACTGGC

ГМО соя линии CV127 не содержит регуляторных последовательностей (35S, NOS и FMV) и распространенных трансгенов. Поэтому для идентификации этой линии при скрининговых исследованиях используют ПЦР с праймерами на трансгенное событие (табл. 2).

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

5.5. Для образцов ГМО культуры, в которых при скрининговых исследованиях не идентифицированы зарегистрированные линии ГМО, но при этом обнаружен CaMV 35S промотор (и не выявлены другие трансгенные последовательности) проводят выявление ДНК вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus - CamV), поражающего ткани растений из семейства капустные (рапс, хрен, капуста, редька, редис, горчица, кресс-салат, брюква, репа, турнепс и др.). Можно использовать для выявления ДНК вируса готовый набор.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

5.6. При выявлении незаявленных ГМ линий проводят идентификацию по п. 3.3. (табл. 2) с использованием валидированных методик из авторитетных научных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

5.7. При необходимости результаты ПЦР исследований дополнительно подтверждаются определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру с терминирующими дидезоксинуклеозидтрифосфатами. Для проведения секвенирования рекомендуется использование систем любого генетического анализатора, и других аналогичных приборов, позволяющих надежно определять нуклеотидную последовательность ДНК длиной до 700-800 пар нуклеотидов в одном прочтении.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

6. Проведение молекулярно-генетических исследований кормовых добавок, содержащих ГМО растительного происхождения.

Экспертное молекулярно-генетическое исследование включают подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие в кормовой добавке возможных недекларированных ГМО.

6.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе образцы кормовой добавки, содержащей ГМО, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

6.2. Подтверждается присутствие в геноме ГМО заявленных трансгенов, выявляется место их локализации, выявляются регуляторные и/или маркерные векторные последовательности (по п. 5.3).

В исследуемом образце должны выявляться регуляторные области, заявленные для данной линии ГМО растительного происхождения, и заявленное трансформационное событие.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

6.3. Проводят скрининговые исследования на наличие в исследуемом образце незаявленных ГМ линий растительного происхождения (по п. 5.4).

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

6.4. Для образцов кормовых добавок, в которых при скрининговых исследованиях не идентифицированы зарегистрированные линии ГМО, но при этом обнаружен CaMV 35S промотор (и не выявлены другие трансгенные последовательности) проводят исследование по п. 5.5.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

6.5. Идентифицируют растительную ДНК в кормовых добавках, используя видоспецифичные праймеры в соответствии с утвержденными для исследований валидированными методиками.

ПЦР-праймеры для идентификации ДНК гена лектина (le1) сои с электрофоретической детекцией по методике ISO/FDIS 21570:2005.

5′ GCC СТС ТАС ТСС АСС ССС АТС С 3′

5′ GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3′;

Размер ПЦР продукта 118 п.н.

ПЦР-праймеры для идентификации ДНК гена инвертазы (ivr1) кукурузы с электрофоретической детекцией по методике ISO/FDIS 21570:2005.

5′-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3′

5′-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3′

Размер ПЦР продукта 225 bp

Для идентификации ДНК кукурузы также можно использовать праймеры в области ген зеина, ПЦР с электрофоретической детекцией.

5′-AGTGCGACCCATATTCCAG-3′

5′-GACATTGTGGCATCATCATTT-3′

Размер ПЦР продукта 277 н. п.

Валидированная (ISO/FDIS 21570:2005) методика для идентификации ДНК гена алкогольдегидрогеназы 1 (adh1) кукурузы с гибридизационно-флюоресцентной детекцией

5′-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3

5′-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3′

5′-(FAM)-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-(TAMRA)-3′

Для идентификации ДНК рапса рекомендуется использование видоспецифичных праймеров в области гена cruA, запасного белка круциферина.

5′-GGCCAGGGTTTCCGTGAT-3′

5′-CCGTCGTTGTAGAACCATTGG-3′

5′-(VIC)-AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA-(TAMRA)-3′

Для выявления присутствия ДНК кукурузы и ДНК сои в кормах и кормовых добавках можно использовать доступные наборы.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

6.6. При выявлении в образцах кормовых добавок незаявленного ГМО, проводят идентификацию ГМ линии по п. 5.3. (табл 2) с использованием валидированных методик из авторитетных научных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

6.7. Для количественного определения ГМО растительного происхождения в кормовых добавках используют методики, основанные на расчете отношения количества ДНК определенной линии ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах. Одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке. Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (сои, кукурузы или др.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание реакций детектируется с помощью двух специфических зондов, меченых флуорофорными метками. Один из зондов используется в реакции обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза), другой - для обнаружения генетической вставки (ГМ линии).

Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов, которые представляют собой смеси ДНК традиционного сорта (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах кормовых добавок.

Исследование на количественное определение ГМО в кормовых добавках растительного происхождения состоит из следующих этапов: выделение ДНК из исследуемого образца, проведение ПЦР в реальном времени, анализ полученных данных с помощью программного обеспечения прибора, расчет и обработка результатов с помощью надлежащего программного обеспечения.

Для количественного определения зарегистрированных на территории РФ трансформационных событий ГМ сои и кукурузы рекомендуется использование методик, представленных заявителями/производителями ГМО, валидированных методик, представленных в авторитетных научных источниках, или готовых ПЦР наборов.

Стандартные сертифицированные образцы, содержащие от 0,1 до 5% различный линий ГМ кукурузы и сои в традиционном сорте растения должны быть доступны из официальных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

При получении результатов, противоречащих или не соответствующих характеристикам, декларированным заявителем/производителем, проводят двукратные повторные арбитражные исследования.