Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения для производства кормов" (подготовлен Минсельхозом России 15.05.2017)

Досье на проект

Пояснительная записка

Методика по проведению молекулярно-генетических исследований генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения для производства кормов

Методика разработана в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации N 839 от 23 сентября 2013 года "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" в части проведения молекулярно-генетических исследований при оценке безопасности ГМО растительного происхождения для производства кормов.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящая методика устанавливает методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения в кормах, а также изучения влияния генетической модификации на функционирование генома ГМ растения.

1.2.Методика предназначена для применения при государственной регистрации ГМ линий растительного происхождения и кормов, содержащих ГМ линии растительного происхождения, а также при мониторинге и выборочном контроле качества продукции для ветеринарного использования, содержащей или изготовленной с использованием ГМО.

1.3. Методика разработана с целью обеспечения единой, научно - обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО и др.).

2. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих заявленные генно-инженерно-модифицированные организмы

2.1. Общая характеристика ГМО растительного происхождения и кормов, содержащих ГМО, включает анализ представленной заявителем документации, содержащей:

- описание свойств, приобретенных организмом в результате модификации;

- описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных или измененных генов,

- характеристику различий ГМО с родительским организмом, в том числе описание способа размножения и распространения, схем выращивания, новых фенотипических свойств.

- характеристику генетической и фенотипической стабильности ГМО с указанием различий с родительским организмом. Должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО, характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы);

- характеристику экспрессии встроенных генов в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения, различия с родительским организмом;

2.2. Описание методик, позволяющих идентифицировать генетическую модификации (трансформационное событие) и таксономический статус организма (вид, сорт). В том числе изучаются протоколы проведения анализов, описание нуклеотидных последовательностей используемых праймеров, стандартные образцы состава и свойств.

2.3. Информацию об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах).

2.4. Информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, данные о токсических, аллергенных свойствах, история использования и др.).

2.5 Информацию о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки).

2.6. Информацию об изучении генетической безопасности и стабильности ГМО.

2.7. Анализируют результаты пострегистрационного мониторинга ГМО и кормов его содержащих, в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований.

3. Проведение молекулярно-генетических исследований ГМО растительного происхождения для производства кормов.

Экспертное молекулярно-генетическое исследование включает подтверждение предоставленных заявителем данных, проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций ГМО культуры, а также изучения влияния генетической модификации на функционирование генома ГМ растения.

3.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе культуры ГМО и его традиционного аналога, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

3.2. Проводят проверку (валидацию) ПЦР методик обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО в кормах, представленных заявителем, оценивают чувствительность и специфичность.

Протоколы проведения анализа, предоставленные заявителем, включает описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Синтез олигонуклеотидов, используемых в качестве ПЦР праймеров, проводят в соответствии с представленной информацией об их нуклеотидных последовательностях.

Необходимое для ПЦР диагностики специализированное оборудование описано в стандартах ИСО 20837:2006 и ИСО 20838:2006. Исследование включает последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца препарата, амплификацию ДНК, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов.

Выделение ДНК из образцов растительного происхождения проводят СТАВ или сорбционным методами в соответствии с ГОСТ Р 52173. Для выделения ДНК сорбционным методом рекомендуется использовать коммерчески доступный набор реагентов в соответствии с наставлениями производителя.

Для проведения ПЦР рекомендуется использование термостабильной ДНК полимеразы, смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, десятикратных буферов для проведения реакций. В зависимости от методики детекция продуктов амплификации осуществляется посредством электрофоретического разделения ПЦР фрагментов в агарозном геле с учётом наличия или отсутствия на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК или посредством учета накопления сигнала флуоресценции в процессе ПЦР при гибридизационно-флюоресцентной детекции

ПЦР методики должны иметь 100% специфичность (отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации до 1х106 геномных эквивалентов /мл) и высокую чувствительность (не менее 1х104 геномных эквивалентов/мл).

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.3. Подтверждается присутствие в геноме ГМО заявленных трансгенов, выявляется место их локализации, выявляются регуляторные и/или маркерные векторные последовательности. Исследование ГМО на наличие заявленных модификаций проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих описание молекулярной структуры генетических конструкций (нуклеотидная последовательность, локализация в геноме реципиента) с использованием валидированных методик идентификации (см п. 3.2.) представленных заявителем/производителем или полученных из авторитетных источников.

Для выявления ДНК регуляторных областей, содержащихся в заявленной генетической конструкции, используют валидированные ПЦР методики (см п. 3.2.) или описанные в стандартах ISO/FDIS 21569:2005. Примеры пар ПЦР-праймеров приведены в таблице 1.

Для выявления ДНК наиболее распространенных регуляторных областей, промоторов р- CaMV35S, р-FMV, терминатора t-NOS, используют готовые ПЦР наборы.

Таблица 1. ПЦР - праймеры для выявления регуляторных элементов генноинженерных конструкций ГМО растительного происхождения

Элемент	ГМ линии сои, кукурузы и рапса содержащие данный элемент	5′ - 3′ последовательности праймеров и зондов
Промотор р-CaMV35S	GTS 40-3-2, A2704-12, A5547-127, BT 176, BT11, MON810, GA21, MON88017, NK603, MON863, T25, Т45 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT FAM-TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA-ТAMRA     ПЦР с электрофоретической детекцией GCTCCTACAAATGCCATCA GATAGTGGGATTGTGCGTCA Размер ПЦР продукта 195 п.н.
Терминатор t-NOS	GTS 40-3-2, MON863, MON531, MON757, MON1076, MON1445, MON1698, MON15985, BT11, GA21, NK603, MON802, 3272, MIR604, MON88017 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CATgTAATgCATgACgTTATTTATg TTgTTTTCTATCgCgTATTAAATgT (YY)-ATgggTTTTTATgATTAgAgTCCCgCAA-(BHQ1)     ПЦР с электрофоретической детекцией GAATCCTGTTGCCGGTCTTG TTATCCTAGTTTGCGCGCTA Размер ПЦР продукта 180 п.н.
Промотор р-FMV	MON89788, MON89034, GT73 и др.	AAGCCTCAACAAGGTCAG CTGCTCGATGTTGACAAG Размер ПЦР продукта 196 п.н.
Промотор p-SSuAra	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GGCCTAAGGAGAGGTGTTGAGA CTCATAGATAACGATAAGATTCATGGAATT FAM-CCTTATCGGCTTGAACCGCTGGAATAA-TAMRA
Промотор p-TA29	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GAAGCTGTGCTAGAGAAGATGTTTATTC GCTCGAAGTATGCACATTTAGCAA FAM-AGTCCAGCCACCCACCTTATGCAAGTC-TAMRA
Промотор p-NOS	MS1, RF1, RF2, Topas 19-2 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: GTGACCTTAGGCGACTTTTGAAC CGCGGGTTTCTGGAGTTTAA FAM-CGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTGCTTAGC-TAMRA
Терминатор t-E9	MON89788 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: TGAGAATGAACAAAAGGACCATATCA TTTTTATTCGGTTTTCGCTATCG FAM-TCATTAACTCTTCTCCATCCATTTCCATTTCACAGT-TAMRA
Терминатор t-35S	BT 176, Т14, Т25, 3272, A2704-12, A5547-127, Т45, Topas19/2 и др.	ПЦР с электрофоретической детекцией GAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTC TTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAG
Терминатор t-OCS	MS1, RF1, RF2 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: CGGTCAAACCTAAAAGACTGATTACA CGCTCGGTGTCGTAGATACT FAM-TCTTATTCAAATTTCAAAAGTGCCCCAGGG-TAMRA
Терминатор t-g7	MS1, RF1, RF2, MS8xRF3 и др.	ПЦР с флюоресцентно-гибридизационной детекцией: ATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTTCAA R ATGTATTACACATAATATCGCACTCAGTCT FAM-ACTGATTATATCAGCTGGTACATTGCCGTAGATGA-TAMRA

Для идентификации и подтверждения ГМ линии (трансформационного события) используют представленную заявителем информацию (см п. 3.2.) и/или валидированные методики из авторитетных источников. Протокол проведения анализа, предоставленный заявителем, включает описание ПЦР-праймеров и режим термоциклирования.

Некоторые предлагаемые праймеры для ПЦР-идентификации некоторых ГМО линий приведены в табл 2.

Табл. 2. Праймеры для выявления некоторых линий ГМ кукурузы, сои и рапса в соответствии с методиками из авторитетных научных источников.

Целевая ДНК	5′ - 3′ последовательности праймеров и зондов
Кукуруза, линия DAS-40278-9	CACGAACCATTGAGTTACAATC FAM-CGTAGCTAACCTTCATTGTATTCCG-TAMRA TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTG
Кукуруза, линия MON87460	CACGTTGAAGGAAAATGGATTG FAM- AGGGAGTATGTAGATAAATTTTCAAAGCGTTAGACGGC-TAMRA TCGCGATCCTCCTCAAAGAC
Кукуруза, линия Bt11	GCGGAACCCCTATTTGTTTA FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA TCCAAGAATCCCTCCATGAG
Кукуруза, линия GA21	CTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA FAM-CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGT- TAMRA TGGCTCGCGATCCTCCT
Кукуруза, линии NK603	ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT
Кукуруза, линия MON863	TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT FAM-TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA-TAMRA GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC
Кукуруза, линия TC1507	TAGTCTTCGGCCAGAATGG FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-TAMRA CTTTGCCAAGATCAAGCG
Кукуруза, линия T25	ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA GACATGATACTCCTTCCACCG
Кукуруза, линия 59122	GGGATAAGCAAGTAAAAGCGCTC FAM-TTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAA-TAMRA CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAG
Кукуруза, линия MIR604	GCGCACGCAATTCAACAG FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT
Кукуруза, линия MON88017	GAGCAGGACCTGCAGAAGCT FAM-TCCCGCCTTCAGTTTAAACAGAGTCGGGT-TAMRA TCCGGAGTTGACCATCCA
Кукуруза, линия LY038	TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT FAM-CGAGCGGAGTTTATGGGTCGACGG-TAMRA AGGAATTCGATATCAAGCTTATCGA
Кукуруза, линия MON89034	TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGBNFQ CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA
Кукуруза, линия 3272	TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGG FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG-TAMRA CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA
Кукуруза, линия MON810	TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT
Кукуруза, линия 98140	GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT FAM-CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATAGTTTAAACT-TAMRA GATTGTCGTTTCCCGCCTTC
Кукуруза, линия MIR162	GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG FAM-TCTAGACAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCCA- TAMRA TGCCTTATCTGTTGCCTTCAGA
Кукуруза LY038	TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT AGGAATTCGATATCAAGCTTATCGA FAM-CGAGCGGAGTTTATGGGTCGACGG-TAMRA
Кукуруза, линия Bt176	GGCCGTGAACGAGCTGTT FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-TAMRA GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA
Соя, линия FG72	AGATTTGATCGGGCTGCAGG FAM-AATGTGGTTCATCCGTCTT-MGBNFQ GCACGTATTGATGACCGCATTA
Соя, линия MON87769	CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATT FAM-CCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGAC-TAMRA GCAAGTTGCTCGTGAAGTTTTG-3′
Соя, линия MON 87705	TTCCCGGACATGAAGCCATTTAC FAM-AAGAGACTCAGGGTGTTGTTATCACTGCGG- TAMRA ACAACGGTGCCTTGGCCCAAAG-3′
Соя, линия A2704-12	GCAAAAAAGCGGTTAGCTCCT FAM-CGGTCCTCCGATCGCCCTTCC-TAMRA ATTCAGGCTGCGCAACTGTT
Соя, линия GTS-40-3-2	TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT FAM-CCTTTTCCATTTGGG-MGB-NFQ GGCATTTGTAGGAGCCACCTT
Соя, линия MON89788	TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT-3′ FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA TCGAGCAGGACCTGCAGAA
Соя, линия A5547-127	GCTATTTGGTGGCATTTTTCCA FAM-CCGCAATGTCATACCGTCATCGTTGT-TAMRA CACTGCGGCCAACTTACTTCT
Соя, линия 305423	CGTGTTCTCTTTTTGGCTAGC FAM-TGACACAAATGATTTTCATACAAAAGTCGAGA-TAMRA GTGACCAATGAATACATAACACAAACTA
Соя, линия DP-356043-5	GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT
Соя, линия MON87701	TGGTGATATGAAGATACATGCTTAGCAT 6-FAM-TCAGTGTTTGACACACACACTAAGCGTGCC- TAMRA CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAA
Соя, линия CV127	5′-AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTAAGAC 6-FAM-TTTGGGGAAGCTGTCCCATGCCC-TAMRA 5′-CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC
Рапс, линия T45	CA ATGGACACATGA ATTATGC GACTCTGTATGAACTGTTCGC FAM-TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT-TAMRA
Рапс, линия Ms8	GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGG- GGAGGGTGTTTTTGGTTATC FAM-AATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTC-TAMRA
Рапс, линия Rf3	CATAAAGGAAGATGGAGACTTGAG 5′-AGCATTTAGCATGTACCATCAGACA FAM-CGCACGCTTATCGACCATAAGCCCA-TAMRA′
Рапс, линия GT73	5′-CCATATTGACCATCATACTCATTGCT 5′-GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-TAMRA
Рапс, линия Ms1	ACGCTGCGGACATCTACATT CTAGATCGGAAGCTGAAGATGG FAM-CTCATTGCTGATCCACCTAGCCGACTT-TAMRA
Рапс, линия, RF1	CTAAGGGAGGTCAAGATGTAGC CGGGCCTAACTTTTGGTGTG FAM-CTCATCATCCTCACCCAGTCAGCATCA-TAMRA
Рапс, линия, RF2	GGGTGAGACAATATATCGACG GGGCATCGCACCGGTGAG′ FAM-CACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGT-TAMRA
Рапс. Topas 19/2	GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC CGACCGGCGCTGATATATGA FAM-TCCCGCGTCATCGGCGG-TAMRA

В исследуемом образце должны выявляться регуляторные области, заявленные для данной линии ГМО растительного происхождения, и заявленное трансформационное событие.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

3.4. Проводят скрининговые исследования на наличие в исследуемом образце незаявленных ГМ линий растительного происхождения:

- регуляторных и/или маркерных последовательностей, вносимых в геном растений при генетических модификациях

- наиболее часто вносимых для получения желаемых признаков целевых трансгенов и других элементов.

Выявление регуляторных элементов ГМО проводят по п. 3.3. (табл. 1).

Примеры пар ПЦР-праймеров, предназначенных для выявления наиболее часто вносимых для получения желаемых признаков целевых трансгенов приведены в табл. 3. Использование данных пар праймеров позволяет идентифицировать основные специфичные для ГМ растений гены: pat и bar, обеспечивающие устойчивость к фосфинотрицину (глюфосинату аммония), cp4 epsp, придающий устойчивость к глифосату, ген cryIA(b), придающий устойчивость к кукурузному мотыльку.

Таблица 3. ПЦР-праймеры для выявления целевых трансгенов, наиболее часто вносимых в геном растений для получения желаемых признаков

Целевой ген	ГМО	ПЦР- праймеры/ зонды, 5′ 3′
ген рat фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы Streptomyces viridochromogenes	линии кукурузы 3272, Bt10, Bt11, GA21, MIR604, 4114, 5307, TC1507, MIR162, 59122, MON810, NK603, MON88017, 676, 678, 680, 98140, DAS40278, Т25 и их гибриды.	TTGAGGGTGTTGTGGCTGGTA     FAM-CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGCA-TAMRA     TGTCCAATCGTAAGCGTTCCT
ген bar фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus	линии кукурузы Bt176, CBH-351, DBT418, DLL25, MS3, MS6, TC6275, сои W62, W98 и др.	ACAAGCACGGTCAACTTCC GAGGTCGTCCGTCCACTC FAM-TACCGAGCCGC AGGA ACC-TAMR A
ген cp4 epsp энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы из СР4 штамма Agrobacterium tumefaciens	линии кукурузы MON802, MON809,MON81, NK603, сои MON87708, MON87769, пшеницы MON87769 и др.	GGGATGACGTTAATTGGCTCTG     GGCTGCTTGCACCGTGAAG     FAM-CACGCCGTGGAAACAGAAGACATGACCTAMRA
Синтетический ген cryIA(b) белка токсина Bacillus thuringiensis	Линии кукурузы BT-176, MON802, MON809, MON810	CCCATCGACATCAGCCTGAGC     FAM-ATGTCCACCAGGCCCAGCACG-TAMRA     CAGGAAGGCGTCCCACTGGC

ГМО соя линии CV127 не содержит регуляторных последовательностей (35S, NOS и FMV) и распространенных трансгенов. Поэтому для идентификации этой линии при скрининговых исследованиях используют ПЦР с праймерами на трансгенное событие (табл 2).

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

3.5. Для образцов ГМО культуры, в которых при скрининговых исследованиях не идентифицированы зарегистрированные линии ГМО, но при этом обнаружен CaMV 35S промотор (и не выявлены другие трансгенные последовательности) проводят выявление ДНК вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus - CamV), поражающего ткани растений из семейства капустные (рапс, хрен, капуста, редька, редис, горчица, кресс-салат, брюква, репа, турнепс и др.). Можно использовать для выявления ДНК вируса готовый набор.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

3.6. При выявлении незаявленных ГМ линий проводят идентификацию по п. 3.3. (табл. 2) с использованием валидированных методик из авторитетных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

3.7. При необходимости результаты ПЦР исследований дополнительно подтверждаются определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру с терминирующими дидезоксинуклеозидтрифосфатами. Для проведения секвенирования рекомендуется использование систем, работающих по данному принципу и позволяющих надежно определять нуклеотидную последовательность ДНК длиной до 700-800 пар нуклеотидов в одном прочтении.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

4. Проведение молекулярно-генетических исследований кормов, содержащих ГМО растительного происхождения.

Экспертные молекулярно-генетические исследования включают подтверждение предоставленных заявителем данных и проверку на наличие в корме возможных недекларированных ГМО.

4.1. Стандартные образцы состава и свойств, в том числе образцы корма, содержащего ГМО, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований предоставляются заявителем.

4.2. Подтверждается присутствие в геноме ГМО заявленных трансгенов, выявляется место их локализации, выявляются регуляторные и/или маркерные векторные последовательности (по п. 3.3).

В исследуемом образце должны выявляться регуляторные области, заявленные для данной линии ГМО растительного происхождения, и заявленное трансформационное событие.

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

4.3. Проводят скрининговые исследования на наличие в исследуемом образце незаявленных ГМ линий растительного происхождения (по п. 3.4):

Срок проведения исследования: не более 45 дней.

4.4. Для образцов кормов, в которых при скрининговых исследованиях не идентифицированы зарегистрированные линии ГМО, но при этом обнаружен CaMV 35S промотор (и не выявлены другие трансгенные последовательности) проводят исследование по п. 3.5.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

4.5. Идентифицируют растительную ДНК в кормах, используя видоспецифичные праймеры в соответствии с утвержденными для исследований валидированными методиками.

ПЦР-праймеры для идентификации ДНК гена лектина (le1) сои с электрофоретической детекцией по методике ISO/FDIS 21570:2005.

5′ GCC СТС ТАС ТСС АСС ССС АТС С 3′

5′ GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3′;

Размер ПЦР продукта 118 п.н.

ПЦР-праймеры для идентификации ДНК гена инвертазы (ivr1) кукурузы с электрофоретической детекцией по методике ISO/FDIS 21570:2005 .

5′-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3′

5′-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3′

Размер ПЦР продукта 225 bp

Для идентификации ДНК кукурузы также можно использовать праймеры в области ген зеина, ПЦР с электрофоретической детекцией.

5′-AGTGCGACCCATATTCCAG-3′

5′-GACATTGTGGCATCATCATTT-3′

Размер ПЦР продукта 277 н. п.

Валидированная (ISO/FDIS 21570:2005) методика для идентификации ДНК гена алкогольдегидрогеназы 1 (adh1) кукурузы с гибридизационно-флюоресцентной детекцией

5′-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3

5′-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3′

5′-(FAM)-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-(TAMRA)-3′

Для идентификации ДНК рапса рекомендуется использование видоспецифичных праймеров в области гена cruA, запасного белка круциферина.

5′-GGCCAGGGTTTCCGTGAT-3′

5′-CCGTCGTTGTAGAACCATTGG-3′

5′-(VIC)-AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA-(TAMRA)-3′

Для выявления присутствия ДНК кукурузы и ДНК сои в кормах и кормовых добавках можно использовать доступные наборы.

Срок проведения исследования: не более 10 дней.

4.6. При выявлении в образцах кормов незаявленного ГМО, проводят идентификацию ГМ линии по п. 3.3. (табл. 2) с использованием валидированных методик из авторитетных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

4.7. Для количественного определения ГМО растительного происхождения в кормах используют методики, основанные на расчете отношения количества ДНК определенной линии ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах. Одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке. Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (сои, кукурузы или др.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание реакций детектируется с помощью двух специфических зондов, меченых флуорофорными метками. Один из зондов используется в реакции обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза), другой - для обнаружения генетической вставки (ГМ линии).

Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов, которые представляют собой смеси ДНК традиционного сорта (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах кормов.

Исследование на количественное определение ГМО в кормах растительного происхождения состоит из следующих этапов: выделение ДНК из исследуемого образца, проведение ПЦР в реальном времени, анализ полученных данных с помощью программного обеспечения прибора, расчет и обработка результатов в специализированных компьютерных программах.

Для количественного определения зарегистрированных на территории РФ трансформационных событий ГМ сои и кукурузы рекомендуется использование методик, представленных заявителями/производителями ГМО, валидированных методик из авторитетных научных источников или готовых ПЦР наборов.

Стандартные сертифицированные образцы, содержащие от 0,1 до 5% различный линий ГМ кукурузы и сои в традиционном сорте растения должны быть получены из официальных источников.

Срок проведения исследования: не более 30 дней.

При получении результатов, противоречащих или не соответствующих характеристикам, декларированным заявителем/производителем, проводят двукратные повторные арбитражные исследования.